[發明專利]檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴增引物及其檢測試劑盒和檢測方法

無效

• 申請號: 200910134866.0
• 申請日: 2009-04-10
• 公開（公告）號: CN101532061A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發明（設計）人: 羅玉柱;胡江;劉秀;王繼卿;馬小軍
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司
• 代理人: 張 真

1.一種檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測方法，其特征是藏綿羊易感等位基因和抗性較強等位基因的確定步驟為：

(1)收集表型正常和患腐蹄病藏綿羊基因組DNA；

(2)利用擴增綿羊腐蹄病相關基因DQA2基因多態性的特異性擴增引物；所述的擴增綿羊腐蹄病相關基因DQA2基因多態性的特異性擴增引物的第一組引物上游引物(DQA2-up)長度為24bp的核苷酸，下游引物(DQA2-dn)長度為22bp的核苷酸，第二組引物上游引物(DQA2s-up)長度為23bp的核苷酸，下游引物(DQA2s-dn)長度為24bp的核苷酸，包括用于擴增OLA-DQA2基因第2外顯子的特異性引物，引物序列如下：

第一組引物：

上游引物24bp：DQA2-up：CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC；

下游引物22bp：DQA2-dn：CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG；

第二組引物：

上游引物23bp：DQA2s-up：ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT；

下游引物24bp：DQA2s-dn：GGAGTAGAATGGTG?GACACTTACC；

其中R＝A或G，Y＝C或T。

(3)用上述特異性引物DQA2-up和DQA2-dn擴增步驟(1)中的DNA特異性片段；

(4)用上述特異性引物DQA2s-up和DQA2s-dn擴增步驟(3)中的PCR產物；

(5)用步驟(4)中的PCR產物進行SSCP檢測；

(6)克隆、測序步驟(5)中產生的各等位基因序列；

(7)根據(5)的基因型判別結果，結合表型觀測資料，確定藏綿羊腐蹄病易感等位基因和抗性等位基因；

(8)確定藏綿羊腐蹄病易感等位基因為OLA-DQA2*H，所述OLA-DQA2*H

的核苷酸序列為：actaccaatc?tcatggtccc?tctggccagt?acacccacga?atttgatggg

gacgagctgt?tttatgtgga?cctggggaag?aaggagactg?tctggcggct?gcctatgttt?ggtgaattca?

caagttttga?cccgcaaggt?gcactgagtg?aaatagctac?agcgaaacaa?aacttggata?tcatgattaa

acgttccaac?tttacccctg?ttatcaatgg?taagtgtcca?ccattctact?cc，抗性等位基因為

OLA-DQA2*L，其核苷酸序列為：actaccaatc?tcatggtccc?tctagcgagt?acaccctgga

atttgacgaa?gacgagctgc?tttatgtgga?cctggagaag?aaagagactg?tctggcggct?gcctatgttt

ggccagtttg?caggttttca?cattcaagtt?gcactgagta?acatagctac?agagaaacac?aacttggatg

tcatgactaa?atggtacaac?tttaccccag?ttatcaatgg?taagtgtcca?ccattctact?cc。

2.如權利要求1所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測方法，其特征在于，檢測所述的藏綿羊DQA2基因的PCR擴增條件為：

第一組引物：PCR反應條件：預變性94℃2min，變性94℃30s，退火64℃30s，延伸72℃50s，共32個循環，最后72℃延伸5min；

第二組引物：PCR反應條件：預變性94℃2min，變性94℃30s，退火67℃30s，延伸72℃30s，共32個循環，最后72℃延伸5min。