[發明專利]人源5,10-次甲基四氫葉酸合成酶及其復合物的結晶方法、晶體以及應用

無效

• 申請號: 200910134474.4
• 申請日: 2009-04-17
• 公開（公告）號: CN101781637A
• 公開（公告）日: 2010-07-21
• 發明（設計）人: 劉志杰;武棟;尼爾·肖恩;成沖云;宋高潔;李楊
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C30B29/54;C30B7/00;C07K16/40;C07K2/00;C12N15/11
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 余剛;張英

技術領域

本發明涉及一種人源5，10-次甲基四氫葉酸合成酶(MTHFS)的晶體及其結晶的方法，同時也涉及人源5，10-次甲基四氫葉酸合成酶與ADP的復合物的晶體及其結晶的方法、人源5，10-次甲基四氫葉酸合成酶與谷氨酸的復合物的晶體及其結晶的方法、人源5，10-次甲基四氫葉酸合成酶與N5-亞胺磷酸過渡態的復合物的晶體及其結晶的方法、人源5，10-次甲基四氫葉酸合成酶與產物10-甲酰四氫葉酸復合物的晶體及其結晶的方法；還涉及這些晶體中對于人源5，10-次甲基四氫葉酸合成酶的酶活性起關鍵作用的結構域或肽片段；以及利用這些重要結構域或肽片段進行藥物設計和篩選的方法。?

背景技術

葉酸，這種水溶性的B族維生素早在19世紀40年代已被發現。葉酸介導的單碳代謝途徑存在于從微生物到高等植物、動物的生命活動中，此代謝途徑對細胞的發育和增殖非常重要，并且在很多生理活動中起著非常重要的作用，因此還原型葉酸是其中重要的輔助因子。葉酸只能在原核生物、酵母、植物中合成，但是對人體卻是必須的，葉酸介導的單碳代謝途徑如果被阻斷，在人體內將引發癌癥，心血管疾病和發育異常等。該代謝途徑中涉及的酶類，很久以來就被用作治療癌癥(Appling，1991；Fox?and?Strover，2008；Chattopadhyay?et.al.，2007；Farber?et.al.，1948)。目前，抗葉酸藥物不僅被用作化療藥物，也在治療風濕性關節炎和銀屑病等疾病中發?揮作用。?

葉酸在生物體內以多種氧化態存在，如：葉酸，二氫葉酸，四氫葉酸等。這些不同狀態的葉酸攜帶的單碳單位也存在不同的氧化狀態如甲醇或甲酸，它們通過酶學反應進行相互的轉換。不同狀態的四氫葉酸可以接受或提供單碳單位給多種生命活動。包括：(1)嘌呤和嘧啶的從頭合成，二磷酸尿嘧啶甲基化形成二磷酸胸腺嘧啶；(2)同型半胱氨酸甲基化形成甲硫氨酸，甲硫氨酸可以形成S-腺苷甲硫氨酸，后者對細胞內的甲基化反應至關重要。嘌呤、嘧啶的從頭合成和同型半胱氨酸的合成都對代謝途徑上游的合成阻斷很敏感，會導致二磷酸尿嘧啶錯誤地摻入DNA當中，并且會提升細胞內的同型半胱氨酸濃度，破壞S-腺苷甲硫氨酸依賴型甲基化反應。葉酸代謝途徑的紊亂將導致多重嚴重疾病，所以該途徑的很多酶都被作為藥物設計的重要靶點。葉酸的單谷氨酸衍生物穿過細胞膜進入細胞，在細胞內被多聚谷氨酸合成酶催化合成不同長度的谷氨酸衍生物，多聚谷氨酸支鏈可以使葉酸存在于細胞內，同時也可以增加其與胞內結合酶類的結合能力。?

5，10-次甲基四氫葉酸合成酶(Homo?sapiens5，10-methenyltetrahydrofolate?synthetase，簡稱MTHFS)，也稱為5-甲酰四氫葉酸環化酶(5-formyltetrahydrofolatecyclo-ligase)。酶學分類號：(EC)6.3.3.2.?

MTHFS催化的體內代謝反應為：?

????????5-甲酰四氫葉酸???????????????????????????????????5，10-次甲基四氫葉酸?

反應的底物為5-甲酰四氫葉酸(5-formyltetrahydrofolate，簡稱5-FTHF)，反應的產物為5，10-次甲基四氫葉酸(5，10-methenyltetrahydrofolate，簡稱5，10-MTHF)。此催化反應在室溫下即可進行，二價鎂離子和ATP(三磷酸腺苷)為5，10-次甲基四氫葉酸合成酶的輔助因子。?