[發明專利]極細枝孢霉生物合成茶黃素粗提物的方法

無效

• 申請號: 200910129072.5
• 申請日: 2009-03-20
• 公開（公告）號: CN101565724A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 傅冬和;趙淑娟;劉仲華
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12P17/16
• 分類號: C12P17/16;C12R1/645
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司
• 代理人: 何 為

技術領域：

本發明涉及一種微生物胞外酶生產茶黃素的方法，尤指一種極細枝孢霉(Cladosporium?tenuissimum)生物合成茶黃素粗提物的方法。?

背景技術：

茶黃素為紅茶的主要活性物質，具有多種藥理與保健功效，某些方面甚至優于兒茶素，在天然藥物、功能食品、日用化工、功能飲料開發等領域有著廣泛的應用前景。目前所利用的茶黃素主要是從紅茶中分離提取，紅茶中茶黃素(TFs)總量含量低，約為0.2％-2.0％，但存在分離純化技術難度大，成本高的缺點，這些技術障礙嚴重阻礙了其開發利用。獲取高含量、低成本的茶黃素已成為茶學界、食品界和醫藥界研究的重要課題。體外模擬氧化(包括酶促氧化和化學氧化)一直作為研究兒茶素氧化機理及紅茶發酵理論簡單、有效的方法，已有學者用此方法研究制備了茶黃素，并獲得了較好的效果。體外氧化制備茶黃素與從紅茶中萃取制備比較，成本要明顯降低。目前體外氧化制備茶黃素主要是通過化學方法或通過酶法制備，但化學方法具有終點難以掌握、反應副產物多等缺點；酶法因存在酶源缺乏、酶活性低等問題而未能廣泛應用。因此，尋找理想的酶源已是體外模擬氧化制備茶黃素的首要任務。?

發明內容：

本發明所要解決的技術問題是：針對上述現有技術的不足，提供一種極細枝孢霉(Cladosporium?tenuissimum)生物合成茶黃素粗提物的方法，從茶黃素合成所需的多酚氧化酶酶源入手，利用微生物繁殖快、易培養、經濟成本低等特點，篩選出高產多酚氧化酶的菌種應用于茶黃素的制備。?

使用的微生物?

本發明從合成茶黃素所需的多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PPO)入手，得到高產多酚氧化酶的菌株極細枝孢霉(Cladosporium?tenuissimum)，該菌株于2009年1月21日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC?NO.2891。?

極細枝孢霉菌株具有下述性質：?

1、形態學特征：?

用顯微鏡觀察菌絲的形態和孢子形態。結果表明：菌絲較細長，較少分枝，孢子從分生梗頂端成堆生長，分生孢子為橢圓形。?

2、培養基上的特征：?

MA瓊脂培養基上，菌落形態為：菌落呈深橄欖色，短絨面，稍隆起。0.2％兒茶素-PDA平板上，生長3d后，出現橙紅色變色圈；培養7d后菌落表面出現同心環紋。?

將分離純化的極細枝孢霉菌種采用BIOLOG-FF鑒定板(重復兩次)及18?S?rDNA分子方法鑒定。此菌種為極細枝孢霉(Cladosporium?tenuissimum)，屬于半知菌類(Fungi?Imperfecti)叢梗孢目(Moniliales)暗梗孢科(Dematiaceae)雙胞亞科(Didymosporoideae)芽枝霉屬(Cladosporium)。?

菌種的制備方法(篩選而得)?

菌種的初篩：從茶園10-20cm深處取土，每克土樣加入19ml的無菌水，并加入玻璃珠，振搖4-6min，稀釋1000倍，取0.2ml接種于上層為PDA固體，下層為每10.0ml的PDA加0.02g兒茶素的固體初篩培養基平板上，將平板置于28℃恒溫培養箱中，靜置培養3天；?

菌種的復篩：將初篩培養基上有氧化圈的菌株劃線接種到每10.0ml的PDA加0.02g兒茶素的固體純化培養基平板上進行培養，直至得到純化的極細枝孢霉菌株。?

再進一步利用純化的極細枝孢霉菌株制備多酚氧化酶粗酶液和酶促氧化制備茶黃素：?

多酚氧化酶粗酶液的制備?

菌種的擴大培養：?

將前述得到的純化菌種轉接種至每10.0ml的PDA含有0.02g大葉種茶兒茶素的液體培養基中，于22-25℃下，以轉速為110-130r/min恒溫振蕩培養4天；?

發酵培養基的配制：?

配制馬鈴薯200g/L、葡萄糖5g/L、NH₄NO₃3g/L、純度大于70％的大葉種茶兒茶素3g/L、CuSO₄0.1mmol/L、FeSO₄0.1mmol/L的發酵液體培養基，培養液體積為容器總體積的50-65％，pH為4.5-5.6，于121℃條件下滅菌20min；?

菌種的接種與發酵：?