[發明專利]赭曲霉毒素A的高密度分子模擬表位肽的制備方法及應用

無效

• 申請號: 200910115449.1
• 申請日: 2009-05-31
• 公開（公告）號: CN101633932A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發明（設計）人: 劉仁榮;劉華
• 申請（專利權）人: 江西科技師范學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;G01N33/543;G01N33/558;C12R1/19
• 代理公司: 南昌新天下專利代理有限公司
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及一種模擬表位肽的制備方法及應用，具體說涉及一種赭曲霉毒素A高 密度分子模擬表位肽的制備方法及其作為競爭抗原在赭曲霉毒素A免疫學檢測方法中 的應用。

技術背景

當前，大量有毒有害物質如黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A等對人體健康和環境造 成了嚴重危害，以酶聯免疫吸附分析方法為代表的免疫學檢測方法具有較高的靈敏度 和特異性，對樣品的純度要求不高，且操作簡單，特別適合于大批量樣本的檢測，已 被廣泛應用黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A等有毒有害物質的快速檢測。

大多數有毒有害物質屬小分子物質，沒有供二株不同抗體結合的表位，必須采用 競爭免疫分析方法進行檢測。因此，需要制備用于競爭免疫分析的競爭抗原。常規制 備競爭抗原用化學方法將這些有毒有害物質與載體偶聯，該方法存在以下弊病：①試 劑本身含有毒有害物質，若操作不慎，會對生產和操作人員的健康造成極大的危害， 并可導致二次污染等環保隱患。②大多數標準品依賴進口，部份標準品難以獲得且價 格昂貴，使檢測試劑的成本居高不下。③偶聯反應的重復性差，部份標準品不穩定， 致使檢測產品的質量難以控制。

由此，科學家們設想用有毒有害物質的替代品參與免疫競爭反應，建立無毒的免 疫學檢測方法。新興的噬菌體隨機肽庫展示技術可高效挑選出能與靶分子相結合的噬 菌體，并利用這些噬菌體再感染大腸桿菌進行擴增，即可獲得大量的能模擬該靶分子 表位的肽。展示用噬菌體的基因組編碼11種蛋白質，其中5種為結構蛋白，與噬菌 體展示密切相關的是二種不同的結構蛋白pVIII和pIII。pVIII是噬菌體的主要衣殼蛋白， 單鏈DNA被包裹在大約2700-3000個pVIII分子組成的管狀結構中。展示在pVIII上的外源 蛋白或多肽由于pVIII拷貝數量大，特別適用于制備基因藥物等需要大量表達的抗原。 次要衣殼蛋白pIII其前體由424個氨基酸殘基組成，形成3-5個拷貝，位于噬菌體的 尾部，是噬菌體感染宿主所必需的。展示在次要衣殼蛋白pIII上的展示肽庫由于拷貝 數少，特別適用于篩選與靶分子有高度親和力的配體分子，如抗原表位研究等。

有文獻報道(劉仁榮，隨機肽庫篩選赭曲霉毒素A模擬表位及其應用，中國公共 衛生，2005，21(8)：944-946)：用抗赭曲霉毒素A單克隆抗體淘選融合到M13噬菌 體次要衣殼蛋白(pIII)上的Ph.D.-7噬菌體展示隨機肽庫，并公布了赭曲霉毒素A的 模擬表位肽序列。然而，這些與抗體有高度親和力的模擬表位肽都是表達在次要衣殼 蛋白上，拷貝數量太少，無法將其直接應用于競爭抗原的制備。其原因在于：競爭免 疫分析方法對競爭抗原上的小分子半抗原表位的密度有一定的要求，若密度太低，競 爭抗原上能結合的抗體數量就太少，導致抗原抗體復合物無法被檢測。因此，在獲得 模擬表位的氨基酸序列后，通常采用化學方法合成模擬表位肽，再通過化學方法將其 偶聯到載體分子上，形成具有一定密度的模擬表位競爭抗原，可以替代赭曲霉毒素A 競爭抗原用于免疫學檢測分析，毒性較赭曲霉毒素A競爭抗原極大降低，但其不可擴 增，成本較使用赭曲霉毒素A標準品有所下降但仍然較高，且費時費力。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種赭曲霉毒素A模擬表位肽的制備方法，得到 的模擬表位肽模擬表位密度高，無需偶聯載體蛋白即可直接替代赭曲霉毒素A競爭抗 原用于競爭免疫分析。

為解決上述技術問題本發明提供如下技術方案，它包括如下步驟：

(1)模擬表位核苷酸序列合成：用化學方法合成二條包含赭曲霉毒素A模擬表位 及5′端分別有核酸內切酶位點EcoRI和BamHI的互補核苷酸序列，退火；

(2)序列導入噬菌體載體擴增：將序列與經相同酶切的噬菌體載體PC89在連接 酶作用下連接(如圖1)，連接產物轉化感受態的E.coli細胞，培養擴增，挑單菌落進 行陽性克隆鑒定；

(3)高密度模擬表位肽的表達和純化。

步驟(1)中所述的所述的互補核苷酸序列最好為

T₁：5′-GAATTCATTCGTCCTATGGTGGATCCG-3′(EcoRI)

和T₂：5′-GGATCCCGGATCCACCATAGGACGAAT-3′(BamHI)。