[發(fā)明專利]赭曲霉毒素A的高密度分子模擬表位肽的制備方法及應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910115449.1
• 申請日: 2009-05-31
• 公開（公告）號: CN101633932A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發(fā)明（設計）人: 劉仁榮;劉華
• 申請（專利權）人: 江西科技師范學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;G01N33/543;G01N33/558;C12R1/19
• 代理公司: 南昌新天下專利代理有限公司
• 代理人: 施秀瑾

1.赭曲霉毒素A高密度模擬表位肽作為固相競爭抗原在赭曲霉毒素A酶聯(lián)免疫檢 測分析中的應用，具體步驟在于：

(1)取純化的高密度模擬表位蛋白，紫外分光光度計測定其在280nm的吸光值 A280nm，根據(jù)Warburg-christian公式：蛋白質濃度mg/ml＝1.55A280nm-0.76A260nm， 確定其蛋白濃度；

(2)采用方陣滴定確定高密度模擬表位蛋白和抗赭曲霉毒素A抗體的最佳使用濃 度；具體如下：

A、用pH7.2PBS磷酸緩沖溶液將高密度模擬表位蛋白配制成40、20、10、5、2.5、 1.25和0.625μg/ml的濃度，按每條酶標板一個濃度，每孔100μL加入酶標板中，4 ℃過夜；

B、傾去包被液，PBST洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣干，每孔加入300μL?3％ 的以PBST為溶劑的脫脂牛奶作為封阻液，37℃保溫保濕1小時；傾去封阻液，PBST洗 滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣干；PBST為PBS加0.2％的吐溫20；

C、將抗赭曲霉毒素A抗體用PBS倍比稀釋成1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶ 8000、1∶16000、1∶32000和1∶64000的濃度，依次加入各條處理好的酶標板板孔 中，最后一孔加入PBS作空白對照，37℃保溫保濕1小時；

D、PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣干；每孔加100μL辣根過氧化物酶標 記的抗抗體即酶標二抗，37℃，保溫保濕1小時；

E、PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣干；每孔加OPD或TMB底物液100μL， 37℃保溫保濕避光反應10分鐘后，每孔加入50μL?2M?H2SO4終止反應，以空白對照 孔調零，在酶標儀上測定酶標板492nm或450nm的吸光值，根據(jù)所有孔吸光值進行比 較，選擇吸光值在1.5左右最低的高密度模擬表位蛋白包被濃度和最大的抗體稀釋度 即為高密度模擬表位蛋白和抗赭曲霉毒素A抗體的最佳使用濃度；

(3)通過化學合成模擬表位多肽IRPMDVP，制作標準曲線確定合成模擬表位多肽 IRPMDVP與赭曲霉毒素A標準品的劑量關系，以之替代赭曲霉毒素A標準品，具體實 施如下：

A、根據(jù)方陣滴定確定的赭曲霉毒素A高密度模擬表位蛋白的濃度；高密度模擬表 位蛋白溶于0.1M?pH8.6的NaHCO₃，100μL/孔，4℃包被過夜；

B、PBST洗板四次，3％脫脂牛奶300μL/孔4℃封閉2h；

C、PBST洗板四次，各孔分別加入不同濃度的赭曲霉毒素A標準品、合成模擬表 位多肽50μL，再全部加入方陣滴定確定的抗赭曲霉毒素A抗體50μL，振蕩混勻，37 ℃保溫保濕1h；

D、PBST洗滌6次，加入辣根過氧化物酶標記的抗抗體，量為100μL/孔，37℃ 作用1h；

E、洗滌6次；聯(lián)苯二胺OPD顯色，2M?H₂SO₄終止反應，測定492nm波長光密度OD 值，計算各濃度的結合率，結合率％＝B/B₀×100％；B0為不加赭曲霉毒素A或不加合成 多肽的OD值，B為加赭曲霉毒素A或加入合成多肽的OD值；

F、根據(jù)赭曲霉毒素A的濃度和結合率繪制赭曲霉毒素A競爭抑制曲線，根據(jù)合成 模擬表位多肽的濃度和結合率繪制多肽競爭抑制曲線，通過參照標準曲線中相同結合 率可得出標準品赭曲霉毒素A與合成模擬表位多肽的劑量關系；

(4)高密度模擬表位蛋白作為競爭抗原替代赭曲霉毒素A人工抗原，合成模擬表 位多肽替代赭曲霉毒素A標準品用于ELISA檢測，具體步驟如下：

A、根據(jù)方陣滴定確定的最佳高密度模擬表位蛋白濃度，用pH7.2PBS磷酸緩沖溶 液稀釋，在酶標板中每孔加100μL高密度模擬表位蛋白，4℃過夜；

B、傾去包被液，PBST洗滌三次，每次在厚疊吸水紙上扣干，每孔加入300μL?3％ 溶于PBST的脫脂牛奶作為封阻液，37℃保溫保濕1小時；傾去封阻液，PBST洗滌三次， 每次在厚疊吸水紙上扣干；其中PBST為PBS加0.2％的吐溫20；

C、在酶標板各孔中加入濃度為40000，20000，10000，5000，2500，1250，625， 312.5，156，100，50和0pg/mL的合成模擬表位多肽或溶于35％甲醇PBS的待測樣品 50μL，再全部加入以PBS稀釋的抗赭曲霉毒素A抗體50μL，同時以PBST代替抗體 設置空白對照，37℃，保溫保濕1小時；

D、PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣干，每孔加100μL辣根過氧化物酶標 記的抗抗體，37℃，保溫保濕1小時；

E、PBST洗板三次，每次在厚疊吸水紙上扣干；每孔加OPD或TMB底物液100μL， 37℃保溫保濕避光反應10分鐘后，每孔加入50μL?2M?H2SO4終止反應，以空白對照 孔調零，在酶標儀上測定酶標板492nm或450nm的吸光值，計算各濃度的結合率，結 合率％＝B/B₀×100％，B₀為合成模擬表位多肽濃度為0時的吸光值，B為合成模擬表位 多肽各濃度的吸光值，同樣計算各待測樣品孔的結合率；B為待測樣品孔的吸光值， 以各合成模擬表位多肽濃度的常用對數(shù)值1gC為橫坐標，各濃度合成模擬表位多肽相 應的結合率為縱坐標制作競爭抑制曲線；

F、以各待測樣品孔的結合率對應的縱坐標，查標準曲線對應的橫坐標，再通過步 驟(3)確定的合成模擬表位多肽與赭曲霉毒素A標準品的劑量關系的標準曲線，即可 得出樣品中赭曲霉毒素A的含量，或可用酶聯(lián)免疫吸附檢測方法專用分析軟件對數(shù)據(jù) 進行分析得出結果；

其中赭曲霉毒素A高密度模擬表位肽依照下列步驟制備：

(1)模擬表位表達載體的構建及鑒定

根據(jù)赭曲霉毒素A的序列，用化學方法合成二條包含赭曲霉毒素A模擬表位及核 酸內切酶位點的核苷酸序列，以其中一模擬表位肽為例，

合成T1：5′-GAATTCATTCGTCCTATGGTGGATCCG-3′

和T2：5′-GGATCCCGGATCCACCATAGGACGAAT-3′，加dd?H₂O分別配成20pmol/ μl的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10μl混合后，置于PCR儀，65℃保溫10min， 然后緩慢降溫至室溫，-20℃保存；

(2)序列導入、鑒定：

取PC89質粒DNA?32μl?30μg，加10×酶切buffer?4μl，10U/μl?EcoRI??2 μl，10U/μl?BamHI?2μl，37℃酶切2h，65℃20min滅活，2.5％瓊脂糖電泳 觀察結果；在紫外燈下迅速切下目的條帶，用UNIQ₂₁₀膠回收試劑盒回收；將回收后的 PC89DNA片段與雙鏈寡聚核苷酸連接；連接反應體系：雙鏈寡聚核苷酸4μl，PC89載 體DNA?4μl，10U/μl?T4DNA?ligase?1μl，10×T4?DNA?ligation?buffer?1μl， 總體積10μl，16℃連接過夜；連接液全量轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，熱激后涂布已 加入40μl?4mg/ml?X-gal及4μl?40mg/ml?ITPG的含Amp的LB平板，37℃培養(yǎng) 過夜，挑單菌落擴增細胞進行陽性克隆鑒定；

(3)高密度模擬表位蛋白的表達：

經(jīng)鑒定后的陽性克隆挑單菌落接種于2ml?Amp+Tet雙抗SOC培養(yǎng)液中，37℃振 蕩培養(yǎng)2h，轉移至400ml?Amp+Tet雙抗SOC培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至A600約 0.4時，加入1×10¹²PFU的VCSM13，37℃振蕩培養(yǎng)1h，再加入終濃度為70mg/L 的卡那霉素以及終濃度為1mmol/L的ITPG，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；

(4)高密度模擬表位蛋白的純化：

將培養(yǎng)液4℃10000rpm離心10min，上清液加入PEG/NaCl，4℃沉淀過夜；4℃ 10000rpm離心15min，去上清，再用1mL?TBST懸浮噬菌體，加入PEG/NaCl冰上孵 育60min；4℃離心15min，去上清，沉淀用200μl?TBST懸浮并測滴度，4℃保存。