[發明專利]一種利用動物肝臟微粒體酶生物合成7-脫氫膽固醇的方法

無效

• 申請號: 200910113920.3
• 申請日: 2009-03-17
• 公開（公告）號: CN101575633A
• 公開（公告）日: 2009-11-11
• 發明（設計）人: 黃時海;李湘萍;夏小斌;吳孔陽;陳桂光;梁智群;張云開;李燦明;汪晟;康超;何鑫平
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12P33/02
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司
• 代理人: 黃永校

技術領域

本發明屬于生化工程和酶工程技術領域。具體涉及一種利用動物肝臟微粒體酶合成7-脫氫膽固醇的方法

背景技術

維生素D₃是人與動物生長、發育、繁殖、維持生命和保持健康必不可少的一種脂溶性維生素。它的主要作用是調節鈣磷代謝，促進腸內鈣磷吸收和骨質鈣化，維持血鈣和血磷的平衡，可用作藥物制劑、食品和飼料添加劑等，在臨床上還可用于治療佝僂病、老年骨質疏松、甲狀腺機能減退癥等。目前維生素D₃是采用光化學法生產，即以7-脫氫膽固醇(7-DHC)為原料，經紫外照射后轉變為維生素D₃前體(PreD₃)，再熱異構化而得。作為主生產原料的7-脫氫膽固醇，可采用多種不同的原料和工藝路線，通過化學合成法制備。如可從羊毛脂提取膽固醇，再進行酯化、氧化生成7-酮膽固醇酯，后者可還原成7α和7β-羥基膽固醇酯，再通過消除反應生成7-脫氫膽固醇。我國中科院理化所張建成等人的工藝路線，則以膽固醇為基本原料，經氧化、加成等一系列反應得到7-脫氫膽固醇。

目前，無論采用何種化學合成法制備原料7-脫氫膽固醇，都有反應步驟長，總產率不高，副反應多，條件難控制，效率偏低，成本高等缺點，從而影響維生素D₃的生產成本、銷售價格、市場推廣。因此，研究開發一種工藝路線短、成本低的7-脫氫膽固醇生產方法變得十分迫切和必要。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用動物肝臟微粒體酶生物合成7-脫氫膽固醇的方法，它能夠克服現有技術中的不足之處，縮短反應步驟，提高總產率，減少副反應，條件易于控制，效率高，成本低。

本發明的技術方案如下：

一種利用動物肝臟微粒體酶生物合成7-脫氫膽固醇的方法，該方法包括以下步驟：

(1)微粒體酶液的制備

將切成塊狀的新鮮肝臟放入pH?7.3、0.1mol/L的谷胱甘肽磷酸緩沖溶液中，在4℃條件下用組織勻漿機勻漿，過濾，濾液進行超聲波細胞破碎，隨后于4℃，12000r·min^-1，10min離心分離，取上清液，得到所述微粒體酶液。

(2)酶促轉化反應

將所述微粒體酶液和促進劑混勻，靜置15min，加入一定量的角鯊烯或羊毛甾醇、還原型輔酶II、三磷酸腺苷、煙酰胺、MgCL₂等混合物，反應5h，得到一種酶促轉化反應液。

(3)皂化反應

步驟(2)反應液加入5ml?15％KOH-乙醇溶液，振蕩反應1h，得到一種皂化反應液。

(4)萃取

步驟(3)反應液用有機溶劑萃取，萃取劑與反應液體積比為6∶1，萃取溫度50℃，萃取時間1h，萃取結束后，氮氣或減壓條件下濃縮。

所述步驟(1)中的肝臟為豬肝、牛肝或羊肝等動物肝臟，緩沖溶液為0.01-0.1mol/L的谷胱甘肽磷酸緩沖溶液，超聲波處理條件為：功率150-400W、溫度4-35℃、時間5-40min；

所述步驟(2)中混合物是1-100ug/ml的角鯊烯或羊毛甾醇、0.1-10mmol/L的還原型輔酶II、0.1-10mmol/L的三磷酸腺苷、1-100mmol/L的煙酰胺、1-10mmol/L?MgCL₂；

所述步驟(3)中皂化反應是加入15％KOH-乙醇溶液，在回流或密閉條件下進行，在60℃振蕩反應1h；

所述步驟(4)中萃取劑石油醚加熱到30-60℃，萃取劑與皂化反應液體積比為4∶1-8∶1，萃取時間1-4h，萃取2-3次。萃取后有機相在40℃氮氣或減壓條件下濃縮。

本發明的有益效果：

本發明從動物肝臟中提取微粒體酶，以角鯊烯或羊毛甾醇為原料，生物合成7-脫氫膽固醇的方法，簡單易行，既可以降低維生素D₃生產成本，又減少環境污染。

附圖說明

圖1為對照樣品的高效液相色譜圖。

圖2-圖6為不同條件下酶促轉化反應液高效液相色譜圖。

圖7為標品7-脫氫膽固醇高效液相色譜圖。

實施例1

(1)微粒體酶液的制備

將50g切成塊狀的新鮮豬肝臟放入pH?5、0.01mol/L的谷胱甘肽磷酸緩沖溶液中，在4℃條件下用組織勻漿機勻漿，兩層紗布過濾，濾液置于超聲波細胞破碎儀中，處理條件為：功率400W、溫度4℃、時間5min。隨后離心(4℃，12000r·min^-1，10min)分離，取上清液，得到所述微粒體酶液。

(2)酶促轉化反應