[發明專利]馬鈴薯晚疫病菌分子檢測引物及其用法

無效

• 申請號: 200910111735.0
• 申請日: 2009-05-12
• 公開（公告）號: CN101643788A
• 公開（公告）日: 2010-02-10
• 發明（設計）人: 李本金;翁啟勇;陳慶河;蘭成忠
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術的領域，更具體涉及一種馬鈴薯晚疫病菌分子檢測引物及其用法。

背景技術

由致病疫霉(Phytophthora?infestans(Mont)de?Bary)引起的晚疫病是導致馬鈴薯莖葉死亡和塊莖腐爛的一種毀滅性的世界病害，自1845年首次在愛爾蘭大流行以后，在世界各馬鈴薯主產區均有發生和流行，嚴重威脅著馬鈴薯的生產，特別是進入20世紀80年代以來，晚疫病在世界各馬鈴薯主產區的頻頻發生及其所造成危害的嚴重程度已引起了國際社會的極大關注。為此，國內外學者對馬鈴薯晚疫病進行了大量研究，并在分子檢測等方面取得了一定進展。

馬鈴薯晚疫病可危害葉片、葉柄、莖、薯塊，不但造成當年生產減產，同時也是次年的初侵染來源，其中潛存于馬鈴薯塊莖中的晚疫病菌是來年晚疫病發生的最主要的初侵染源。帶菌種薯播種后，病菌便在發芽形成的幼苗上沿其表皮縱向侵染，形成中心病株。病部產生的孢子囊也可借助風雨傳播而侵染附近植株的下部葉片，進而使地上部表現癥狀，形成發病中心，致該病由點到面，迅速蔓延擴大。病葉上的孢子囊還可隨雨水或灌溉水滲入土中侵染薯塊，形成病薯，成為翌年主要侵染源。該病的發生和流行受品種和氣象條件的影響較大，其中又以氣象條件為主。在適宜的溫、濕度條件下，晚疫病菌產生的孢子囊能迅速繁殖，多次再侵染，很快引致大流行。同時，馬鈴薯晚疫病菌是由A1、A2兩種交配型進行異宗配合的卵菌，A2交配型的出現，意味著有性生殖可以順利實現，從而產生更具有侵染力和適合度更高的生理小種以及致病力更強的菌株，加重了病害的發生與流行。因此建立馬鈴薯晚疫病菌分子檢測體系，早期對發病植株及種薯進行晚疫病菌快速檢測，進而監測晚疫病的發生發展情況，對防止該病從發病區向未發病區擴散蔓延以及馬鈴薯晚疫病早期預測預報和有效防治策略的制定都具有重要的理論和實際意義。

馬鈴薯晚疫病具有很強的傳染性，一旦擴散蔓延則難以控制。目前對晚疫病菌的檢測大多仍沿用傳統的培養及鑒定方法，但該病在按常規方法分離的過程中，由于晚疫病菌生長速度較慢，經常被包括腐霉在內的其它雜菌所掩蓋，給該菌的成功分離和病害的準確診斷造成很大困難。因此，以形態特征為基礎的常規病害診斷技術，由于其耗時長，效率和靈敏度均較低，難以滿足對馬鈴薯晚疫病診斷的實際需要，因其很容易錯過病害防治的最佳時期。因此，建立一套結果可靠、易于操作、靈敏度高的馬鈴薯晚疫病菌快速檢測診斷技術不僅非常必要，而且十迫切。

隨著科學技術的發展，許多新的技術方法不斷引入該領域，其中PCR技術以其快速、靈敏和準確等優點已廣泛應用于植物病害的研究。核糖體轉錄間隔區是20世紀90年代發展起來的全新的分子標記。利用核糖體轉錄間隔區ITS序列在物種進化過程中的保守性和異變性設計引物進行PCR擴增已在棉花、番茄、西瓜等作物的病害檢測中得到了廣泛的應用。隨著卵菌不同種ITS序列數據的積累，以該區域為靶標序列設計特異引物用于疫霉菌的檢測已有成功報道。但我國在馬鈴薯晚疫病菌分子檢測方面研究甚少，并且存在檢測特異性不強，靈敏度低的問題，因此研制快速檢測馬鈴薯晚疫病菌的技術，在植物病害的癥狀還未顯現出來之前，就能對植物體內病原菌進行可靠的檢測，這對制訂病害防治最佳時期至關重要。

發明內容

本發明的目的是提供一種馬鈴薯晚疫病菌分子檢測引物及其用法，針對現有技術中馬鈴薯晚疫病菌的生物學檢測方法所需周期長、目前馬鈴薯晚疫病菌分子檢測方法特異性差，靈敏度低的問題，本發明的馬鈴薯晚疫病菌的特異分子檢測引物以及方法結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高，該方法可用于帶菌的植株和種薯的高靈敏度快速分子檢測，此技術對于馬鈴薯晚疫病菌引起病害顯癥之前的早期監測，對于確定病害防治最佳時期具有重要的作用，為防治策略的制定提供科學依據。

本發明的馬鈴薯晚疫病菌分子檢測引物：所述馬鈴薯晚疫病菌分子檢測的一對PCR引物，即特異分子檢測引物的序列為：

上游引物INF1：5‘-CGGTTGGTTTTCGGACCGA-3’

下游引物INF2：5‘-CATTTCCCAAATGGATCGACC-3’；所述引物INF1/INF2對馬鈴薯晚疫病菌特異性擴增出324bp的產物。