[發明專利]馬鈴薯晚疫病菌分子檢測引物及其用法

無效

• 申請號: 200910111735.0
• 申請日: 2009-05-12
• 公開（公告）號: CN101643788A
• 公開（公告）日: 2010-02-10
• 發明（設計）人: 李本金;翁啟勇;陳慶河;蘭成忠
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司
• 代理人: 蔡學俊

1.一種馬鈴薯晚疫病菌分子檢測引物，其特征在于：所述馬鈴薯晚疫病菌分子檢測的一對PCR引物，即特異分子檢測引物的序列為：

上游引物INF1：5‘-CGGTTGGTTTTCGGACCGA-3’

下游引物INF2：5‘CATTTCCCAAATGGATCGACC-3’

2.根據權利要求1所述的馬鈴薯晚疫病菌分子檢測引物，其特征在于：所述引物INF1和INF2對馬鈴薯晚疫病菌特異性擴增出324bp的產物。

3.根據權利要求1所述的馬鈴薯晚疫病菌分子檢測引物，其特征在于：所述的馬鈴薯晚疫病菌分子檢測引物的序列獲得方法為：采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA，具體方法如下：取50mg冷凍干燥后的菌絲粉于1.5ml離心管中，加入900μl重量濃度為2％十六烷基三甲基溴化銨CTAB提取液和90μl重量濃度10％十二烷基苯磺酸鈉SDS后振蕩混勻，于55～60℃水浴1.5h，每10min顛倒混勻一次，水浴1.5h后離心8min，離心速度為12,000rpm，取上清液加入等體積的酚、氯仿和異戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚∶氯仿∶異戊醇的體積比為：25∶24∶1，顛倒使充分混勻，離心12min，離心速度為12,000rpm，取上清液，即水相，加入等體積氯仿和異戊醇的混合溶液抽提一次，所述混合溶液中氯仿∶異戊醇的體積比為：24∶1，顛倒使充分混勻，離心5min，離心速度為12,000rpm，吸上清液，加0.1體積的3mol/L?NaAC溶液和2體積的-20℃無水乙醇，置-20℃下沉淀30min以上，12,000rpm離心5min，輕輕地倒去上清液，加入700μl體積濃度70％的-20℃乙醇進行洗滌，在超凈工作臺上自然晾干無酒精味后用1×TE溶液進行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至50ng/μl待用，在馬鈴薯晚疫病菌特異DNA片段序列的基礎上應用ClustalX軟件比對設計特異引物，所述特異引物為上游引物INF1：5‘-CGGTTGGTTTTCGGACCGA-3’，下游引物INF2：5‘-CATTTCCCAAATGGATCGACC-3’；經對供試菌株和28株馬鈴薯晚疫病菌的特異性進行PCR驗證，所述馬鈴薯晚疫病菌分子檢測引物在馬鈴薯晚疫病菌中特異性地擴增出324bp的產物。

4.根據權利要求3所述的馬鈴薯晚疫病菌分子檢測引物，其特征在于：所述十六烷基三甲基溴化銨CTAB提取液為重量濃度2％CTAB；100m?mol/L?Tris-HCl，PH?8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl。

5.根據權利要求3所述的馬鈴薯晚疫病菌分子檢測引物，其特征在于：所述1×TE溶液為10mmol/LTris-HCL，0.1mmol/LEDTA，pH8.0。

6.根據權利要求3所述的馬鈴薯晚疫病菌分子檢測引物，其特征在于：所述經對供試菌株和28株馬鈴薯晚疫病菌的特異性進行PCR驗證的具體的反應體系是：PCR反應體系25μl，包括2.5μl?10×PCR反應緩沖液，2.0mmol/L?Mg²⁺，200μmol/L?dNTPs，1.0U?Taq?DNA聚合酶，引物INF1和INF2各0.08μmol/L和50ng模板DNA，d.d.H₂O補足25μl；PCR反應條件為：94℃預變性2.5min；94℃變性30sec，68℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35個循環；72℃延伸7min。