[發明專利]檢測水泡性口炎抗體試劑盒及其制備方法

無效

• 申請號: 200910109418.5
• 申請日: 2009-08-17
• 公開（公告）號: CN101625363A
• 公開（公告）日: 2010-01-13
• 發明（設計）人: 花群義;楊俊興;張彩虹;阮周曦;曾少靈;曹琛福;林慶燕;秦智鋒;陳書琨;陶虹
• 申請（專利權）人: 花群義
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/535;C12N15/06;C12P21/08
• 代理公司: 深圳市順天達專利商標代理有限公司
• 代理人: 陸 軍

1、一種檢測水泡性口炎病毒抗體試劑盒，其特征在于，包括分別放置的試劑I和試劑II，其中所述試劑I為水泡性口炎病毒抗原包被酶聯免疫吸附試驗測定板，所述試劑II為單克隆抗體IgG-HRP酶結合物，其中所述單克隆抗體IgG-HRP酶結合物為辣根過氧化酶標記的鼠抗水泡性口炎病毒的特異性單克隆抗體。

2、根據權利要求1所述的檢測水泡性口炎病毒抗體試劑盒，其特征在于，還包括分別放置的陽性血清、陰性血清、20倍濃縮洗滌液、10倍濃縮洗滌液、底物I、底物II、底物III以及終止液。

3、根據權利要求2所述的檢測水泡性口炎病毒抗體試劑盒，其特征在于，所述20倍濃縮洗滌液為20倍濃縮的含0.05％Tween-20的0.01mol/L?pH?7.4PBS/PBST；10倍濃縮稀釋液為10倍濃縮的含1％明膠的PBST；底物I為pH6.0的乙酸-檸檬酸緩沖液；底物II為3.3’-5.5’-四甲基聯苯胺溶液；底物III為雙氧水溶液；終止液為1mol/L?H₂SO₄硫酸溶液。

4、根據權利要求2或3所述的檢測水泡性口炎病毒抗體試劑盒，其特征在于，各組成部分的體積或數量如下：

試劑盒組成部分名稱：????????????????????????????體積或數量：

水泡性口炎病毒抗原包被酶聯免疫吸附試驗測定板????2板96孔酶標板

單克隆抗體IgG-HRP酶結合物???????????????????????0.5ml

陽性血清????????????????????????????????????????1ml

陰性血清????????????????????????????????????????1ml

20倍濃縮洗滌液??????????????????????????????????50ml

10倍濃縮稀釋液??????????????????????????????????30ml

底物I???????????????????????????????????????????20ml

底物II??????????????????????????????????????????2ml

底物III?????????????????????????????????????????1ml

終止液??????????????????????????????????????????20ml。

5、根據權利要求1-3中任一項所述的檢測水泡性口炎病毒抗體試劑盒，其特征在于，所述水泡性口炎病毒抗原包被酶聯免疫吸附試驗測定板通過以下方法制備：將純化后的水泡性口炎病毒抗原用優化好的包被緩沖液稀釋成4.0μg/mL，以50μL/孔加入酶聯免疫吸附試驗測定板，置4℃冰箱中過夜包被后拍干酶聯免疫吸附試驗測定板；然后以200μL/孔加入優化好的封閉液，置4℃冰箱中封閉過夜后徹底拍干。

6、根據權利要求5所述的檢測水泡性口炎病毒抗體試劑盒，其特征在于，所述水泡性口炎病毒抗原通過以下方法制備：BHK-21細胞長成單層后接種水泡性口炎病毒并使用無血清的基礎培養基培養，在細胞病變達75％以上時收獲病毒，反復凍融3次后以8000轉/分鐘離心30分鐘，取上清液，加入終濃度為1/3000的甲醛滅活病毒，采用20％、60％的不連續蔗糖密度梯度20000轉/分鐘4℃超速離心3小時，收獲提純的病毒條帶作為抗原。

7、一種如權利要求1所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括：

(1)使用水泡性口炎病毒制備水泡性口炎病毒抗原；

(2)使用提純的水泡性口炎病毒抗原免疫小鼠并取免疫小鼠的脾細胞，將所述脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在融合劑下融合后篩選獲得雜交瘤細胞，將所述雜交瘤細胞注入小鼠制備抗水泡性口炎病毒單克隆抗體腹水；

(3)使用抗水泡性口炎病毒單克隆抗體腹水制備抗水泡性口炎病毒單克隆抗體辣根過氧化酶酶結合物；

(4)制備水泡性口炎病毒抗原包被酶聯免疫吸附試驗測定板：將純化后的水泡性口炎病毒抗原用優化好的包被緩沖液稀釋成4.0μg/mL后加入酶聯免疫吸附試驗測定板，置冰箱中過夜包被后拍干酶聯免疫吸附試驗測定板；然后在酶聯免疫吸附試驗測定板的孔內加入優化好的封閉液，置冰箱中封閉過夜后徹底拍干。