[發(fā)明專利]大豆檢疫性病毒病害多重實時熒光PCR檢測方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910106536.0
• 申請日: 2009-04-10
• 公開（公告）號: CN101857904A
• 公開（公告）日: 2010-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 章桂明;陳枝楠;程穎慧;王穎
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281
• 代理人: 羅瑤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種同時檢測煙草環(huán)斑病毒、南方菜豆花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、南芥菜花葉病毒四種中一種或多種大豆病毒病害的簡單、快速、特異、靈敏的實時熒光PCR檢測方法及其試劑盒。適合于口岸檢驗檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護等部門使用。

背景技術(shù)

大豆(Glycine?max)是我國重要的油料作物和糧食作物，也是世界上食用油和植物蛋白的主要來源，在我國國民經(jīng)濟中占有重要地位。目前我國大豆產(chǎn)量居世界第四位，但仍然不能滿足國內(nèi)植物油及飼料蛋白加工的需要。隨著我國進口大豆的數(shù)量逐年遞增，各種危害大豆生產(chǎn)的病害傳入的風險也逐漸增大。其中本發(fā)明涉及的四種大豆病毒病害是目前嚴重影響大豆生產(chǎn)及貿(mào)易的病毒病害，具有重要的檢疫重要性和經(jīng)濟重要性。

煙草環(huán)斑病毒(Tobacco?Ringspot?Virus，簡稱TRSV)是豇豆花葉病毒科(Comoviridae)，線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)的成員。其寄主范圍很廣，能夠侵染包括豆類、瓜類、薯類、花卉和果樹等在內(nèi)的54科300余種植物，并引起重大經(jīng)濟損失。TRSV可經(jīng)汁液摩擦接種、介體及種子傳播。其癥狀變化多樣，常有隱癥現(xiàn)象等，給常規(guī)診斷帶來困難，甚至出現(xiàn)漏檢。該病毒分布于美國、加拿大、巴西、阿根廷等的30多個國家，中國僅山東、寧夏和陜西有發(fā)生報道。

南芥菜花葉病毒(Arabis?mosaic?virus，簡稱ArMV)是豇豆花葉病毒科(Comoviridae)，線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)成員。ArMV寄主范圍廣泛，可侵染174屬215種植物，自然侵染并危害多種瓜類、豆類、花卉和果樹，引起花葉、黃化褪綠、矮化、皺縮甚至壞死等癥狀。可以通過種子及鱗球、塊莖及苗木等無性繁殖材料遠距離傳播。目主要分布在美國、加拿大、澳大利亞、荷蘭、比利時、新西蘭、南非、日本等20多個國家，中國尚未有發(fā)生的報道。

番茄環(huán)斑病毒(Tomato?ringspot?virus，簡稱ToRSV)是豇豆花葉病毒科(Comoviridae)，線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)的成員。1936年P(guān)rice等首次報道在美國新澤西州發(fā)現(xiàn)ToRSV。該病毒寄主范圍廣泛，能侵染105個屬157種單、雙子葉植物，常見的自然寄主有番茄、煙草、大豆、葡萄、蘋果等具有重要經(jīng)濟價值的作物和果樹，造成嚴重的經(jīng)濟損失。ToRSV在不同寄主上表現(xiàn)癥狀不同，但一般都引起植株矮化、葉片斑點、果實畸形。ToRSV有多種傳播方式，在田間通過介體劍線蟲等昆蟲和嫁接傳播，而遠距離傳播主要是靠種子、苗木調(diào)運。目前在美國、巴西、加拿大、澳大利亞等30多個國家有分布，中國尚無發(fā)生報道。

南芥菜花葉病毒(Southern?bean?mosaic?virus，簡稱SBMV)屬于南芥菜花葉病毒屬成員，侵染能力強，適應(yīng)性廣。1942年Zawmey和Harter首先報道。該病毒自然狀況下可引起菜豆、大豆、豇豆和黑綠豆的花葉、斑駁病害，導致花、果、種子數(shù)量下降，產(chǎn)量降低。該病毒傳播途徑多樣，汁液和種子均能傳毒。主要包括SBMV-B和SBMV-C兩個株系，前者能侵染菜豆的大多數(shù)品種，后者只能侵染豇豆。該病毒一直引起世界各國的高度重視。分布在美國、巴西、墨西哥、法國、印度等國家，中國僅貴州有分布。

目前對上述四種病毒都存在多種檢測方法，但各個病毒采用不同的體系，不利于高通量檢測工作的進行。并且在對同一種病毒檢測中，不同的檢測體系之間存在的誤差嚴重影響檢測的準確性和可靠性。此外，在國內(nèi)外大豆上重要病毒病害檢測中還沒有實現(xiàn)了多種病毒的同時檢測。隨著我國對進口大豆需求的增加，各種大豆病害傳入的風險也不斷增加，對我國的大豆生產(chǎn)構(gòu)成巨大的潛在威脅。因此，在口岸檢疫部門采用簡單、快速、特異、靈敏的檢測方法對其中具有嚴重影響的病害進行檢測，對保護我國大豆生產(chǎn)，防止其重要檢疫性病原的傳入具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提出快速、可靠、靈敏度高、特異性強和價格便宜的檢測煙草環(huán)斑病毒、南方菜豆花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、南芥菜花葉病毒四種大豆病毒重要病害的引物、寡核苷酸探針、試劑盒及多重實時熒光PCR檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種用于大豆病毒病害實時熒光PCR檢測的引物和寡核苷酸探針，至少包括選自表1兩組以上病毒的一對引物和對應(yīng)的寡核苷酸探針。

表1多重實時熒光PCR檢測各種大豆病毒病害對應(yīng)各組的引物和寡核苷酸探針一覽表