[發(fā)明專利]體外檢測(cè)精子-卵母細(xì)胞相互作用的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910104998.9
• 申請(qǐng)日: 2009-01-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101482555A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉瑜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 劉瑜
• 主分類號(hào): G01N33/48
• 分類號(hào): G01N33/48;G01N21/64
• 代理公司: 深圳市中知專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 張學(xué)群

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體外檢測(cè)精子-卵母細(xì)胞相互作用的方法，更具體地，涉及體外聯(lián)合檢測(cè)精子-卵母細(xì)胞相互作用的方法。

背景技術(shù)

哺乳動(dòng)物的精子必須具備良好的生理功能才能完成受精過(guò)程。受精是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要經(jīng)歷精子與卵細(xì)胞透明帶結(jié)合、透明帶誘發(fā)頂體反應(yīng)和精子穿過(guò)透明帶并與卵黃膜結(jié)合等過(guò)程才能完成，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題均可導(dǎo)致受精失敗。可通過(guò)精子-卵母細(xì)胞相互作用試驗(yàn)對(duì)這些過(guò)程進(jìn)行體外評(píng)估，從而尋找不孕不育的病因，并為輔助生殖助孕方式的選擇提供直接的科學(xué)依據(jù)。

精子-卵母細(xì)胞相互作用試驗(yàn)包括精子-透明帶結(jié)合試驗(yàn)、透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)試驗(yàn)和精子-透明帶穿透試驗(yàn)，通常需要分成三個(gè)不同檢測(cè)項(xiàng)目分別進(jìn)行檢測(cè)，需要消耗較多標(biāo)本資源，檢測(cè)成本高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)且檢測(cè)效率低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于減少標(biāo)本資源的消耗，降低檢測(cè)成本，降低檢測(cè)時(shí)間并提高檢測(cè)效率。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種體外檢測(cè)精子-卵母細(xì)胞相互作用的方法，所述方法包括如下步驟：a.上泳法或密度梯度法提取精子；b.在培養(yǎng)液中按一定比例混合經(jīng)步驟a提取后的精子與卵母細(xì)胞，另設(shè)立卵母細(xì)胞空白對(duì)照，并均置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)；c.去除步驟b中未與卵母細(xì)胞表面結(jié)合的精子，倒置相差顯微鏡下檢測(cè)與卵母細(xì)胞透明帶結(jié)合的精子數(shù)量；d.使步驟c中與卵母細(xì)胞透明帶結(jié)合的精子和卵母細(xì)胞分離，分別收集分離后的精子和卵母細(xì)胞；e.將卵母細(xì)胞空白對(duì)照精子、經(jīng)步驟d分離后的精子涂于載玻片上，干燥，固定液固定，洗滌，加入熒光素-凝集素標(biāo)記物，反應(yīng)后再次洗滌，熒光顯微鏡下檢測(cè)精子頂體反應(yīng)率；f.倒置相差顯微鏡下檢測(cè)經(jīng)步驟d分離的卵母細(xì)胞胞內(nèi)已穿透進(jìn)入其中的精子數(shù)量。

其中所述步驟c中通過(guò)以下方法去除步驟b中未與卵母細(xì)胞表面結(jié)合的精子：將反應(yīng)后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一盛有培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打卵母細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移精子-卵母細(xì)胞結(jié)合物至另一盛有培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

其中所述步驟d中通過(guò)以下方法使步驟c中與卵母細(xì)胞透明帶結(jié)合的精子和卵母細(xì)胞分離：將精子-卵母細(xì)胞結(jié)合物移入微滴中，反復(fù)吹打卵母細(xì)胞，然后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一盛有培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

其中所述培養(yǎng)液的NaCl重量含量為0.28-1.11％、KCl重量含量為0.02-0.07％、CaCl₂·2H₂O重量含量為0.01-0.05％、KH₂PO₄重量含量為0.01-0.03％、MgSO4·7H₂O重量含量為0.01-0.06％、酚紅重量含量為0.0005-0.003‰、NaHCO₃重量含量為0.10-0.42％、葡萄糖重量含量為0.05-0.20％、焦丙酮酸鈉重量含量為0.015-0.060‰、BSA重量含量為0.17-0.70％、青霉素的含量為10000-20000單位％、硫酸鏈霉素重量含量為0.05-0.50‰和乳酸鈉糖漿(600g/L)體積含量為0.18-0.74％，余量為蒸餾水。

其中所述步驟b中的卵母細(xì)胞可以是新鮮卵母細(xì)胞或者是保存在卵細(xì)胞保存液中的卵母細(xì)胞，其中所述卵細(xì)胞保存液的(NH₄)₂SO₄重量含量為6.6-26.4％和Tris重量含量為0.12-0.48％，余量為蒸餾水，其pH值為7.0-7.8。

其中可在步驟e中熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)精子頂體反應(yīng)率之前加入熒光封固液，所述熒光封固液是含對(duì)苯二胺的磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.5-9.0。

其中所述步驟e中固定液是多聚甲醛、丙酮和甲醇的混合液。

其中所述步驟e中洗滌所使用的洗滌液是含Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.2-7.6。

其中所述步驟e中熒光素-凝集素標(biāo)記物中的熒光素為異硫氰酸熒光素(FITC)或四甲基異硫氰酸若丹明(TRITC)，凝集素為刀豆蛋白A、豌豆凝集素或花生凝集素。

本發(fā)明的有益效果在于實(shí)現(xiàn)了精子-透明帶結(jié)合試驗(yàn)、透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)和精子-透明帶穿透試驗(yàn)三個(gè)項(xiàng)目的聯(lián)合檢測(cè)，并由此減少了精子標(biāo)本的消耗，尤其是減少了來(lái)源困難的卵母細(xì)胞的消耗，較大程度地節(jié)約了標(biāo)本資源；減少了操作環(huán)節(jié)，較大程度地降低了檢測(cè)成本；減少了操作步驟，降低了操作時(shí)間，大大提高了檢測(cè)效率；同時(shí)所述檢測(cè)方法具有較高的準(zhǔn)確性，有利于臨床常規(guī)應(yīng)用與推廣。

具體實(shí)施方式