[發明專利]體外檢測精子-卵母細胞相互作用的方法

無效

• 申請號: 200910104998.9
• 申請日: 2009-01-13
• 公開（公告）號: CN101482555A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發明（設計）人: 劉瑜
• 申請（專利權）人: 劉瑜
• 主分類號: G01N33/48
• 分類號: G01N33/48;G01N21/64
• 代理公司: 深圳市中知專利商標代理有限公司
• 代理人: 張學群

1.一種體外檢測精子-卵母細胞相互作用的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

a.上泳法或密度梯度法提取精子；

b.在培養液中按一定比例混合經步驟a提取后的精子與卵母細胞，另設立卵母細胞空白對照，并均置于培養箱中反應；

c.去除步驟b中未與卵母細胞表面結合的精子，倒置相差顯微鏡下檢測與卵母細胞透明帶結合的精子數量；

d.使步驟c中與卵母細胞透明帶結合的精子和卵母細胞分離，分別收集分離后的精子和卵母細胞；

e.將卵母細胞空白對照精子、經步驟d分離后的精子涂于載玻片上，干燥，固定液固定，洗滌，加入熒光素-凝集素標記物，反應后再次洗滌，熒光顯微鏡下檢測精子頂體反應率；

f.倒置相差顯微鏡下檢測經步驟d分離的卵母細胞胞內已穿透進入其中的精子數量。

2.權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟c中通過以下方法去除步驟b中未與卵母細胞表面結合的精子：將反應后的卵母細胞轉移至另一盛有培養液的細胞培養皿中，反復吹打卵母細胞，然后轉移精子-卵母細胞結合物至另一盛有培養液的細胞培養皿中。

3.權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟d中通過以下方法使步驟c中與卵母細胞透明帶結合的精子和卵母細胞分離：將精子-卵母細胞結合物移入微滴中，反復吹打卵母細胞，然后將卵母細胞轉移至另一盛有培養液的細胞培養皿中。

4.權利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，其中所述培養液的NaCl重量含量為0.28-1.11％、KCl重量含量為0.02-0.07％、CaCl₂·2H₂O重量含量為0.01-0.05％、KH₂PO₄重量含量為0.01-0.03％、MgSO4·7H₂O重量含量為0.01-0.06％、酚紅重量含量為0.0005-0.003‰、NaHCO₃重量含量為0.10-0.42％、葡萄糖重量含量為0.05-0.20％、焦丙酮酸鈉重量含量為0.015-0.060‰、BSA重量含量為0.17-0.70％、青霉素的含量為10000-20000單位％、硫酸鏈霉素重量含量為0.05-0.50‰和乳酸鈉糖漿(600g/L)體積含量為0.18-0.74％，余量為蒸餾水。

5.權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟b中的卵母細胞可以是新鮮卵母細胞或者是保存在卵細胞保存液中的卵母細胞，其中所述卵細胞保存液的(NH₄)₂SO₄重量含量為6.6-26.4％和Tris重量含量為0.12-0.48％，余量為蒸餾水，其pH值為7.0-7.8。

6.權利要求1所述的方法，其特征在于，其中可在步驟e中熒光顯微鏡下計數精子頂體反應率之前加入熒光封固液。

7.權利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述熒光封固液是含對苯二胺的磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.5-9.0。

8.權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟e中固定液是多聚甲醛、丙酮和甲醇的混合液。

9.權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟e中洗滌所使用的洗滌液是含Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.2-7.6。

10.權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟e中熒光素-凝集素標記物中的熒光素為異硫氰酸熒光素FITC或四甲基異硫氰酸若丹明TRITC，凝集素為刀豆蛋白A、豌豆凝集素或花生凝集素。