[發明專利]一種柑桔碎葉病毒分子變異的快速檢測方法

無效

• 申請號: 200910103937.0
• 申請日: 2009-05-25
• 公開（公告）號: CN101560577A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發明（設計）人: 宋震;周常勇;李中安
• 申請（專利權）人: 西南大學;中國農業科學院柑桔研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司
• 代理人: 周韶紅

技術領域

本發明涉及病毒檢測技術領域，特別是涉及一種柑桔碎葉病毒分子變異的快速檢測方法。

背景技術

柑桔碎葉病毒(Citrus?tatter?leaf?virus，CTLV)引起的柑桔碎葉病是威脅柑桔生產的重要病害之一，可以導致以枳作砧木的寬皮柑桔減產25％左右。柑桔碎葉病毒在美國、日本、南非、澳大利亞和中國等多個國家已有發生，尤其以日本和中國最為普遍。在浙江、湖南、福建和廣西等省的局部地區柑桔碎葉病毒已造成比較嚴重的為害。柑桔碎葉病毒是RNA病毒，極易發生重組、突變，一旦強致病性的變異株系出現流行，將給柑桔產業帶來不可估量的損失。

目前為止，指示植物鑒定是檢測柑桔碎葉病毒株系變異的重要依據和手段之一。蘇鴻基根據柑桔碎葉病在臘斯克枳橙和特洛亞枳橙上的癥狀，將柑桔碎葉病毒劃分為致病力強弱不同的株系。何新華等(1996)曾對11個柑桔碎葉病毒分離株致病力強弱進行比較。雖然用指示植物能夠檢測柑桔碎葉病毒的株系變異，但是費工、費時(30-45天)、成本高，而且受環境的影響較大(溫度高于30℃不表現癥狀)，并且不能明確變異的分子特征。

隨著分子生物學的發展，許多科學工作者開始通過柑桔碎葉病毒全部或部分核苷酸序列測定來研究其分子變異，目前已測定了來源于蘋果的P-209、百合的L和Li-23等7個分離株的全基因組核苷酸序列。Magome等(1997)對6個來源于蘋果、日本梨和歐洲梨的分離物以及2個來源于柑桔的柑桔碎葉病毒分離物的V-區、CP和ORF2編碼蛋白氨基酸序列進行研究，結果表明不同來源的病毒分離物包含2-4個分子變種，用V-區、CP和ORF2編碼蛋白氨基酸序列構建的系統發育樹中，這些分離物和分子變種可分為幾個組群。但是序列測定成本較高，并需要大型儀器設備，不適合高通量大規模進行。

單鏈構象多態性(SSCP)分析精確性高，理論上能檢測到只有一個堿基突變的序列差異。Magome等(1999)根據研究發現柑桔碎葉病毒存在高度可變區(V-區)，利用SSCP技術研究了柑桔碎葉病毒V區的序列變異。該方法定義變異的類型比較困難，需要單一的標準分離株，因而重復性較差，不同實驗室的結果之間可能存在差異，并且該方法電泳時間較長，后期的染色程序比較復雜，結果判定需要豐富的經驗。

到目前為止，尚無適合高通量快速檢測柑桔碎葉病毒分子變異的方法報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種柑桔碎葉病毒分子變異的快速檢測方法。該方法具有速度快、成本低、重復性好、穩定性高、操作性強等特點，適合大規模、高通量的樣品分析，適用于田間樣品檢測、柑桔碎葉病毒流行監控、脫毒苗木鑒定等多種用途。

本發明的目的通過如下措施來實現：

一種柑桔碎葉病毒分子變異的快速檢測方法，技術路線是用特異性引物對柑桔碎葉病毒基因組特定區域的核酸序列進行逆轉錄聚合酶鏈式擴增(RT-PCR)，并應用限制性內切酶對其擴增產物進行消化，依據電泳圖譜診斷柑桔碎葉病毒的分子變異。

該方法依次包括下述步驟：

(1)取適量柑桔碎葉病毒寄主植物的葉或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液按常規方法提取樣品總核酸或RNA；

(2)根據柑桔碎葉病毒的保守序列設計特異引物，以所提取的核酸為模版，對柑桔碎葉病毒基因組特定區域進行逆轉錄聚合酶鏈式擴增；

(3)應用限制性內切酶對柑桔碎葉病毒的RT-PCR產物進行消化；

(4)瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰氨凝膠電泳、染色、獲取電泳圖譜；

(5)依據上述圖譜的條帶特征診斷柑桔碎葉病毒的分子變異類型。

上述方法中：

步驟(2)所述的柑桔碎葉病毒基因組特定區域是指包含或部分包含外殼蛋白基因、運動蛋白基因或其它基因的核酸序列。

步驟(3)所述的限制性內切酶是指Taq?I、Mse?I、HinfI或其它限制性內切酶中的1種或2種。

附圖說明

圖1是本發明檢測結果示意圖

1-7：柑桔碎葉病毒分子變異類型；M：DNA標準Marker

本發明相比現有技術具有如下優點：

(1)速度快：從樣品制備到獲取可用于診斷柑桔碎葉病毒分子變異的酶切圖譜可在一天內完成。

(2)操作簡便，重復性好、穩定性高：同一樣品的不同檢測批次，不同人員操作，其結果一致性100％。

(3)適合大規模、高通量的樣品分析：一次可輕松處理幾十個樣品。

具體實施方式

下述實施例是為清楚說明本發明而進行的進一步詳細描述，不構成對本發明的任何限定：