[發明專利]量子點標記核酸探針及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 200910103353.3
• 申請日: 2009-03-11
• 公開（公告）號: CN101525668A
• 公開（公告）日: 2009-09-09
• 發明（設計）人: 羅陽;王玨;府偉靈;黃君富
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10;G01N21/64
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及分子生物學和細胞遺傳學領域，特別涉及量子點標記核酸探 針及其制備方法和應用。

背景技術

不同物種的染色體都有各自特定的形態結構特征(包括染色體的長度、 著絲點位置、臂比、隨體大小等)，而且這種形態結構特征是相對穩定的。 因此，染色體核型分析是遺傳研究的重要內容，對于人類染色體病和惡性腫 瘤的發生、發展、轉移機制研究也具有重要的科學意義。

染色體核型分析的傳統方法主要為染色體G顯帶法，具有操作簡單、費 用低廉的優點，可準確區別出各號染色體及較大片段的缺失、重復和倒位， 但無法確定標記染色體的來源，無法檢測微小或復雜的染色體易位。熒光原 位雜交(fluorescence?in?situ?hybridization，FISH)是20世紀80年代末期在 放射性原位雜交技術的基礎上以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的 原位雜交技術。因具有經濟、安全、快速、穩定等特點，目前已廣泛應用于 動植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析、人類產 前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究等諸多領域。其基本原理是用已知的 標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進 行特異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上 是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進行雜交從而 將特定的基因在染色體上定位。近年來在FISH的基礎上又建立了多色熒光 原位雜交(M-FISH)和光譜核型分析(SKY)，使用5種熒光染料通過不同 的組合和比例標記24種探針，雜交后24條染色體各自呈現特異的熒光，從 而實現了人類全基因組染色體核型圖譜的繪制，為研究人員提供了更加豐富 詳盡的細胞遺傳學信息，包括確定標記染色體的來源、檢測微小或復雜的染 色體易位等，尤其為高度重排的腫瘤細胞染色體分析提供了全新、高效的方 法。

本發明人運用M-FISH技術進行了多項前期研究：對宮頸脫落細胞人類 染色體末端酶(hTERC)基因拷貝數的變化進行了檢測以判斷其與人乳頭狀 瘤病毒(HPV)感染、分型的相關性；對膀胱移行細胞癌患者尿液脫落細胞 進行了檢測并證實3、7和17號染色體數目畸變與膀胱癌的臨床病理分期有 顯著相關性。但前期研究結果發現，現有M-FISH技術存在如下問題：(1) 熒光染料的熒光強度弱且背景噪音高，檢測靈敏度較低；(2)不同熒光染料 的光譜間干擾嚴重影響結果判斷，檢測特異性較弱；(3)熒光染料的光漂白 現象明顯，檢測重復性較差；(4)不同熒光染料的激發需用不同濾鏡組，而 在濾鏡組之間切換時容易產生假陽性結果。因此，如何提高檢測的靈敏度、 特異性和重復性、減少假陽性結果是M-FISH技術應用于臨床急需解決的關 鍵問題。

量子點(quantum?dots，QDs)的出現為克服以上問題帶來了希望。量子 點是一種直徑在1～10nm之間，能夠接受激發光產生熒光的半導體納米顆 粒，由周期表中II-VI族或III-V族元素組成。其相對于熒光染料具有許多優 點：(1)發射波長可調諧，通過控制量子點的大小和組成，可以調節其發射 熒光的顏色；(2)激發波長范圍寬，從紫外區到近紅外區，可以用同一波長 的光激發不同發射波長的量子點；(3)發射峰狹窄且對稱，半高峰寬通常為 25～45nm；(4)熒光強度高且穩定，對光漂白有強烈的抵制作用。由于上 述優良的光譜特性，近年來量子點作為新型熒光標記物在腫瘤活體成像與靶 向治療、分子診斷等領域已顯示出巨大潛力。但迄今為止，尚未見量子點標記 核酸探針及其制備方法和應用的研究報道。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種量子點標記核酸探針，可以克 服現有的熒光染料標記核酸探針存在的熒光強度較弱、易光漂白、不同熒光染 料標記核酸探針需不同波長激發且光譜間干擾較大等缺陷。

為達到此目的，本發明提供了一種量子點標記核酸探針，具有不同序列的 探針標記有具有不同發射光譜特征的量子點。