[發(fā)明專利]量子點(diǎn)標(biāo)記核酸探針及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910103353.3
• 申請日: 2009-03-11
• 公開（公告）號: CN101525668A
• 公開（公告）日: 2009-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅陽;王玨;府偉靈;黃君富
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10;G01N21/64
• 代理公司: 北京同恒源知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 趙榮之

1.非診斷目的的應(yīng)用量子點(diǎn)標(biāo)記核酸探針進(jìn)行染色體核型分析的方法，其特征在于：包括以下步驟：

a、合成24種全染色體涂抹探針并用生物素進(jìn)行標(biāo)記；

b、合成24種具有不同發(fā)射光譜特征的量子點(diǎn)并用鏈霉親和素進(jìn)行標(biāo)記，具體如下：

將氯化鎘CdCl₂·2.5H₂O和巰基乙酸MAA的混合溶液用濃度為1?mol/L的NaOH?溶液調(diào)節(jié)pH至10.2，通氮?dú)?0分鐘后，在攪拌條件下加入新制的碲氫化鈉NaHTe溶液，Cd²⁺/Te^2-/MAA的摩爾比為1∶0.5∶2.4，繼續(xù)攪拌20分鐘，制得橙色的CdTe量子點(diǎn)前驅(qū)體溶液；將此前驅(qū)體溶液在100℃水浴中回流反應(yīng)不同時(shí)間，制得24種具有不同發(fā)射光譜特征且表面修飾有羧基的CdTe量子點(diǎn)溶液，最大發(fā)射波長分別為440nm、450nm、460nm、475nm、490nm、510nm、520nm、530nm、540nm、550nm、560nm、575nm、580nm、590nm、605nm、610nm、620nm、630nm、640nm、650nm、660nm、670nm、680nm和690nm；在上述CdTe量子點(diǎn)溶液中分別加入異丙醇以降低CdTe量子點(diǎn)的溶解度，再于10000r/min離心30分鐘，棄上清，即得純化的CdTe量子點(diǎn)；

在濃度為0.1?mol/L、pH為8.5的磷酸鹽緩沖液即PBS中，加入表面修飾有羧基的CdTe量子點(diǎn)0.6?mg和濃度為8.7g/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺即EDC?250μL，EDC用量為量子點(diǎn)的50~100倍，混勻，再加入鏈霉親和素0.12mg，室溫下攪拌反應(yīng)3?小時(shí)后，上Sephadex?G100層析柱，用濃度為0.1?mol/L、pH為7.4的PBS洗脫，得純化的鏈霉親和素標(biāo)記的CdTe量子點(diǎn)溶液；按照上述方法，對24種具有不同發(fā)射光譜特征且表面修飾有羧基的CdTe量子點(diǎn)分別進(jìn)行鏈霉親和素標(biāo)記，制得24種具有不同發(fā)射光譜特征且鏈霉親和素標(biāo)記的CdTe量子點(diǎn)；

c、將生物素標(biāo)記的全染色體涂抹探針與鏈霉親和素標(biāo)記的量子點(diǎn)通過生物素與鏈霉親和素的特異性結(jié)合進(jìn)行偶聯(lián)，使具有不同序列的全染色體涂抹探針標(biāo)記上具有不同發(fā)射光譜特征的量子點(diǎn)，具體如下：

將鏈霉親和素標(biāo)記的CdTe量子點(diǎn)先用pH為7.4的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性位點(diǎn)，再與生物素標(biāo)記的全染色體涂抹探針在pH為8.0的PBS中室溫避光反應(yīng)24小時(shí)，最后用層析柱分離純化，即得CdTe量子點(diǎn)標(biāo)記的全染色體涂抹探針；按照上述方法，將24種具有不同發(fā)射光譜特征且鏈霉親和素標(biāo)記的CdTe量子點(diǎn)與24種生物素標(biāo)記的全染色體涂抹探針通過生物素與鏈霉親和素的特異性結(jié)合進(jìn)行偶聯(lián)，使具有不同序列的全染色體涂抹探針標(biāo)記上具有不同發(fā)射光譜特征的量子點(diǎn)，即得24種發(fā)射不同顏色熒光的量子點(diǎn)標(biāo)記全染色體涂抹探針，置-20℃避光保存；

d、應(yīng)用上述制得的量子點(diǎn)標(biāo)記全染色體涂抹探針進(jìn)行染色體核型分析，具體如下：

d1、制備中期染色體標(biāo)本

取多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓涂片，用濃度為0.4μg/mL的秋水仙胺處理1.5小時(shí)，37℃胰酶消化6分鐘，加入濃度為0.075mol/L的氯化鉀溶液10mL，輕輕吹打均勻，37℃水浴30分鐘，加入預(yù)冷的固定液固定，所述固定液為甲醇∶冰醋酸=3∶1的混合液，再將細(xì)胞懸液滴至載玻片上，過夜干燥，即得中期染色體標(biāo)本，置-20℃保存；

d2、將量子點(diǎn)標(biāo)記核酸探針和中期染色體標(biāo)本進(jìn)行原位雜交，具體如下：

中期染色體標(biāo)本的預(yù)雜交：取中期染色體標(biāo)本，滴加濃度為100?μg/mL的RNA酶溶液，所述RNA酶溶液是將濃度為10?mg/ml的RNA酶溶液用2×SSC緩沖液稀釋制得，所述2×SSC緩沖液由濃度為0.3mol/L的氯化鈉和濃度為0.03mol/L的檸檬酸三鈉組成，蓋上蓋玻片，37℃孵育30分鐘，用2×SSC緩沖液漂去蓋玻片并洗滌5分鐘，再滴加質(zhì)量百分濃度為0.05%的胃蛋白酶溶液，所述胃蛋白酶溶液是將質(zhì)量百分濃度為10%的胃蛋白酶溶液用濃度為1mol/L的HCl溶液稀釋制得，蓋上蓋玻片，37℃孵育10分鐘，用2×SSC緩沖液漂去蓋玻片并洗滌5分鐘，再置體積百分濃度為1%的甲醛溶液中，37℃固定10分鐘，用PBS洗滌5分鐘，再立即依次置預(yù)冷的體積百分濃度為70%、90%、100%的乙醇系列溶液中脫水，每次5分鐘，自然干燥；

量子點(diǎn)標(biāo)記核酸探針和中期染色體標(biāo)本的原位雜交：將經(jīng)過預(yù)雜交處理的中期染色體標(biāo)本置體積百分濃度為70%的甲酰胺溶液中變性3分鐘，所述甲酰胺溶液用2×SSC緩沖液配制，再立即依次置預(yù)冷的體積百分濃度為70%、90%、100%的乙醇系列溶液中脫水，每次5分鐘，自然干燥；將24種量子點(diǎn)標(biāo)記核酸探針在75℃恒溫水浴中溫育5分鐘，之后立即在0℃靜置5~10分鐘，使雙鏈DNA探針變性；將已變性的24種量子點(diǎn)標(biāo)記核酸探針滴加在已變性的中期染色體標(biāo)本上，蓋上蓋玻片，用橡皮泥封片，再轉(zhuǎn)移至潮濕暗盒中，控制雜交pH為6~7，37℃雜交24小時(shí)；

中期染色體標(biāo)本的漂洗：雜交完畢后，取出中期染色體標(biāo)本，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉，先用預(yù)熱至73℃的體積百分濃度為0.3%的乙基苯基聚乙二醇即NP-40溶液洗滌2分鐘，所述NP-40溶液用0.4×SSC緩沖液配制，再在室溫下用體積百分濃度為0.3%的NP-40溶液洗滌1分鐘，PBS洗滌2分鐘，再置體積百分濃度為70%、90%、100%的乙醇系列溶液中脫水，每次5分鐘，自然干燥，再用4，6-二氨基-2-苯基吲哚即DAPI復(fù)染，PBS洗滌多余的DAPI，自然干燥，置-20℃保存；

d3、對雜交信號進(jìn)行熒光檢測

將雜交后的中期染色體標(biāo)本置安裝有冷CCD攝像頭的熒光顯微鏡下，進(jìn)行多色熒光原位雜交的圖像采集和數(shù)據(jù)處理，繪制24色人類全基因組染色體核型圖譜。