[發明專利]人α防御素5活性肽的基因工程制備方法

有效

• 申請號: 200910103227.8
• 申請日: 2009-02-23
• 公開（公告）號: CN101525629A
• 公開（公告）日: 2009-09-09
• 發明（設計）人: 王艾平;王軍平;粟永萍;程天民;王崧;申明強;陳默
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 重慶志合專利事務所
• 代理人: 胡榮琿

技術領域

本發明屬于生物工程制藥領域，具體涉及一種具有殺滅細菌和抗病毒生物活性多肽-人α防御素5活性肽的基因工程制備方法。?

背景技術

當前細菌和病毒感染仍然是人類生命和健康的主要威脅。自上世紀早期青霉素和磺胺藥問世以來，人類已發明了近百種主要以干擾細菌的核酸或蛋白質的代謝與合成或抑制細菌胞壁合成的機理達到抗細菌目的的抗菌素，然而由于這些傳統抗生素的作用機制容易誘導細菌發生突變而產生耐藥性。臨床實踐中已發現針對傳統抗生素的多種耐藥菌株，使得人類再次面臨致病細菌的挑戰。因此，人們一直在努力尋求與開發新型的抗菌素。另一方面，自從首例艾滋病病例的出現以來，又有SARS病毒、流感病毒、肝炎病毒、登革熱病毒等病毒所致疾病的暴發與流行，使得人類的生命時常面臨危機。由于病毒的基因很容易發生突變，病毒所致的損傷往往有宿主免疫系統的功能失誤參與，至今人們尚未尋找到可長期使用且具有特效抗病毒的藥物。因此除應用目前通過抑制病毒核酸或蛋白酶，或利用免疫因子殺傷病毒，或利用病毒疫苗免疫人體等機理生產的藥物外，還必須尋找其他更為高效低毒的抗病毒藥物。?

經過近二十年的研究，發現在植物、昆蟲和包括人在內的高等動物機體內存在近千種內源性陽離子肽------防御素(Defensin)(Shalin?Seebah?et?al，Nucleic?Acids?Research，2007，35：262-268)。具有活性的防御素分子一般為3-6kD的非糖基化多肽，多數分子內存在6～8個保守半胱氨酸殘基形成的3～4對鏈內二硫鍵外，還富含精氨酸、脯氨酸等特殊殘基，整個分子在中性溶液中帶正電荷；晶體衍射揭示防御素分子具有α螺旋、β折疊、二硫鍵橋、無規卷?曲等單種或多種二級結構所形成的單體或多聚體空間結構。根據二硫鍵等結構的組成方式，防御素被分為α、β和θ等類型。研究已證實，有805種防御素具有快速、強效地殺滅多種細菌的活性；有261種防御素具有抗白色念珠菌等真菌和螺旋體的作用；有48種防御素具有抗HIV、HPV和或HSV等病毒的效果；有54種防御素可產生抗癌細胞的生物效應。此外，防御素作為機體免疫系統的重要組成部分，參與了免疫調節等多種生物學功能。研究顯示防御素的抗微生物活性與其結構相關，通過其所具有的凈電荷、疏水性與親水性、空間構象與極向角等因素構成的特征性機理殺傷細菌(Michiael?R.et?al，Pharmacol?Rev，2003，55：27-55)，因此防御素直接擾亂細菌胞膜的結構進而破壞胞膜的通透性和細胞能量狀態，導致細胞膜去極化、呼吸作用受抑制，以及細胞ATP含量下降，最終致靶細菌死亡。防御素的抗病毒作用則是通過與病毒衣殼中的靶分子結合而導致病毒失去感染宿主細胞的生物活性(E?Hazrati?et?al，J?Immunol，2006，177：8659-8666)。由于這些特殊的作用機理，使防御素具備兩個特點：一是抗微生物譜廣，二是靶微生物難以對其產生抗性突變。因此，生物學家認為防御素可能成為一種新型的抗生素，在作為抗感染制劑、食品防腐劑等方面具有廣闊的應用前景。?

迄今為止，相繼發現了6種人α-防御素(HNP1-4，HD5，HD6)和6種人β-防御素(HBD1-6)。人α防御素5活性肽是分子量為3.58KD的陽離子短肽，含保守的6個半胱氨酸殘基，構成3個分子內二硫鍵，形成由3條穩定的β-折疊片構成的兩歧性分子。研究發現，HD5除在人腸道潘氏細胞中大量分泌表達外；在生殖道上皮細胞、鼻粘膜和部分正常支氣管粘膜等細胞中存在固有表達，還可因炎癥、感染和細胞惡性轉變等因素的刺激而表達、分泌上調。研究表明，化學合成、從粘膜組織中提取和轉基因小鼠表達的HD5不僅具有高效而廣譜的抑菌和參與免疫保護調節的活性，而且具有阻止HIV、HSV等病毒粘附進入細胞和抑制病毒顆粒復制的抗病毒作用(N.H.Salzman?et?al，Nature，2003，422：522-526；Bryan?Ericksen?et?al，Antimicrobial?Agent?andChemotherapy，2005：269-275；C.B.Buck?et?al，Proc?Natl?Acad?Sci，2006，103：1516-1521)。由此可見，HD5在消化道、生殖道等粘膜內源性感染預防和免疫保護調節中發揮著重要作用。另一方面，HD5是機體與病原微生物相互?作用過程的進化產物，其具有特異識別與殺傷病原微生物的活性，理論上對人體不會產生免疫抗體等毒副效應，因此HD5是具有良好開發前景的新型抗病原微生物的藥物候選分子。?