[發明專利]人α防御素5活性肽的基因工程制備方法

有效

• 申請號: 200910103227.8
• 申請日: 2009-02-23
• 公開（公告）號: CN101525629A
• 公開（公告）日: 2009-09-09
• 發明（設計）人: 王艾平;王軍平;粟永萍;程天民;王崧;申明強;陳默
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 重慶志合專利事務所
• 代理人: 胡榮琿

1.一種人α防御素5活性肽的基因工程制備方法，其特征在于包括步驟：

1)目的基因的獲取：設計合成寡核苷酸引物SEQ?ID?NO：7-9并重疊延伸 擴增出SEQ?ID?NO：2所示序列的DNA；

2)將步驟1)所得目的基因，與線性化pPIC9K共轉化，通過Red/ET同源 重組構建重組表達質粒；

3)將步驟2)所得重組表達質粒轉化入酵母細胞中，篩選出基因組中整合 有多拷貝目的基因的酵母克隆株，所述酵母為畢赤巴斯德酵母菌株GS115；

4)高密度培養步驟3)所篩選的酵母克隆株，并用甲醇誘導目的基因的高 效表達；

5)從步驟4)所獲得的發酵上清中分離純化人α防御素5活性肽。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)包括采用限制性內切酶 Sac?I酶切步驟2)所述重組表達質粒，獲得具有可發生多次單交換同源重組以 致于多拷貝目的基因整合入酵母細胞基因組的游離AOX1?5’端的線型化重組表 達質粒。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟3)包括采用兩次電擊轉化 方法將線型化重組表達質粒轉化入酵母細胞中，再利用G418抗性表型和組氨酸 合成能力與甲醇利用能力表型篩選獲得基因組中整合有多拷貝目的基因的酵母 克隆株。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟4)包括采用生物發酵罐高 密度培養權利要求3所述的酵母克隆株和用甲醇誘導目的肽的表達，采用高效 液相色譜層析法連續監測目的肽的含量，以獲得高效表達目的肽的發酵上清。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于步驟4)中采用生物發酵罐時， 發酵溫度控制在28～30℃，溶解氧含量控制在30％～40％之間，pH值控制在3.5～ 5.0。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟5)包括采用捕獲純化、組 分分離純化和精純化3個步驟從權利要求4所述的發酵上清中純化獲得人α防 御素5活性肽；所述捕獲純化步驟包括應用超速離心沉淀分離法、連續超濾更 換緩沖溶液法；所述組分分離純化步驟包括應用陽離子交換層析；所述精純化 步驟包括應用反相層析法。