[發(fā)明專利]高產(chǎn)聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株及其篩選方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910102277.4
• 申請日: 2009-09-10
• 公開（公告）號: CN101921714A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發(fā)明（設計）人: 蔣冬花;周琴
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江師范大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/04;C12P7/62;C12R1/11
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術醫(yī)學及生活領域，尤其涉及一種高產(chǎn)聚-β-羥丁酸(PHB)的巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)Bm-10菌株及其用途。

背景技術

聚-β-羥丁酸(PHB)是細胞內(nèi)的一類生物聚酯，其力學性質(zhì)與一些熱塑性材料如聚丙烯相似，并且可以被微生物完全降解，因而被稱之為“生物可降解塑料”，是真正的環(huán)境友好型產(chǎn)品。研究生物可降解塑料來替代化學合成塑料可以幫助我們解決塑料污染問題，節(jié)約能源，實現(xiàn)資源與環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。PHB是微生物在碳、氮等營養(yǎng)失衡的條件下合成的碳源與能源的高分子儲存物(分子量50000～1000000)。作為微生物合成的可降解材料，PHB除了具有與化學合成高分子相似的理化性質(zhì)，還具有一般化學合成高分子所沒有的性質(zhì)如光學活性、低透氧性、抗紫外輻射、生物可降解性、生物相容性、壓電性和抗凝血性等，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、食品、醫(yī)藥等領域具有十分廣闊的應用前景。如在醫(yī)療領域，PHB可以作為藥物基質(zhì)植入人體，以控制藥物的釋放，且最終降解產(chǎn)物為β-羥基丁酸，沒有任何毒副作用。

自發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)可以積累PHB以來，國內(nèi)外許多研究者致力于PHB的研究。英國、日本、加拿大、美國等已實現(xiàn)了PHB的工業(yè)化生產(chǎn)。國內(nèi)PHB的研究起步較晚，但也取得了一定的成果。中科院微生物所、山東大學、清華大學等在PHB的研究方面已經(jīng)取得了一些研究成果和進展。但總的來說相對于化學合成塑料，PHB的生產(chǎn)成本仍然較高，約為傳統(tǒng)塑料生產(chǎn)成本的數(shù)倍至十幾倍。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對市場上對可降解塑料需求的日益增長，而現(xiàn)有技術中利用微生物法生產(chǎn)可降解塑料菌種產(chǎn)量低、成本高等問題。本發(fā)明的一個目的是提供高產(chǎn)聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株，該菌株從污泥中篩選獲得，可用于PHB的微生物制備。本發(fā)明另外的一個目的是提供上述的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株的用途。

為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術方案：

高產(chǎn)聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株，高產(chǎn)聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株的保藏號為：CCTCC?NO：M209131，保藏單位為：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為：中國武漢武漢大學，保藏日期為：2009年6月25日，分類命名為：巨大芽孢桿菌Bm-10?Bacillus?megaterium?Bm-10。該菌株菌落乳白色不透明，圓形，較大、直徑約3～6mm，表面光滑，邊緣整齊，無特殊氣味。顯微鏡觀察細胞呈桿狀或近橢圓形桿狀，粗大，長度約3～5μm，寬度約1.2～1.5μm；趨于扭曲的短鏈；周生鞭毛，具運動性；革蘭氏染色陽性。16S?rDNA電泳和測序分析結(jié)果表明，其長度為1513bp，與巨大芽孢桿菌(B.megaterium)菌株的同源性達99.7％。鑒定該菌株為巨大芽孢桿菌(B.megaterium)。對該菌體內(nèi)的PHB通過蘇丹黑染色進行初步定性定量測定，細胞內(nèi)含量較多。

上述的高產(chǎn)聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株的篩選方法如下：取0.2g土壤，加入5mL蒸餾水，85℃加熱15min，進行10^-1～10^-4梯度稀釋，選擇10^-2濃度100μL涂布牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)24h，出現(xiàn)圓形乳白色菌落；挑取單菌落，進一步分離、純化后，獲得菌株。

作為優(yōu)選，所述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方包括牛肉膏20g、蛋白胨5g、氯化鈉5g、水1L，pH?7.2。

為實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明的高產(chǎn)聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株用于聚-β-羥丁酸的制備。

高產(chǎn)聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株用于聚-β-羥丁酸的制備方法，該方法包括以下的步驟：

①挑取適量菌種接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，30℃活化培養(yǎng)20～30h；裝入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，取培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液，按4～10％的接種量接種后，30℃，200r/min，搖瓶培養(yǎng)80～120h，可得PHB含量占菌體干重的45％～55％的巨大芽孢桿菌菌體；

②將搖瓶所得培養(yǎng)液10000r/min離心5min，收集菌體，無菌水洗滌3次后再用丙酮洗滌一次，之后加氯仿與酒精的混合液提取PHB，然后40℃干燥后可得到白色沉淀即為PHB。

本發(fā)明由于采用了上述的技術方案，從污泥中篩選獲得高產(chǎn)聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株，該菌株可用于PHB的微生物制備，解決了現(xiàn)有技術中利用微生物法生產(chǎn)可降解塑料菌種產(chǎn)量低、成本高等問題。

附圖說明