[發明專利]一種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法

有效

• 申請號: 200910101859.0
• 申請日: 2009-09-03
• 公開（公告）號: CN101691616A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發明（設計）人: 費建明;王文兵;李玉峰;白雪川;施國方
• 申請（專利權）人: 湖州市農業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 湖州金衛知識產權代理事務所(普通合伙) 33232
• 代理人: 趙衛康

技術領域

本發明涉及病原體的鑒定及桑樹及其幼苗轉運中的檢疫等用途， 尤其涉及桑樹及其幼苗在轉運中的檢疫等應用，屬于生物檢測技術領 域。

背景技術

桑花葉型萎縮病又稱“癃桑”。早在1313年古農書中就有記載(王 禎農書，元代圣慶2年)。現今在江、浙蠶農所謂的“癃桑”，實際上 具有多種癥狀。其中，葉部呈現黃綠相間的花葉癥的一種，定名為桑 花葉型萎縮病(蒯元璋，1965)。此病僅分布在中國，在我國的浙江、 四川、安徽、江蘇、江西、云南、上海、重慶等省、市蠶區均有發生。 因此，此病已成為國內重要的桑樹病害。1990年在病桑組織內發現 類似類病毒(Viroid)的小分子RNA病原體(蒯元璋、田波等，1990)。 2007年，費建明等獲得了該病原體的部分序列(費建明等，2007)， 并于2008年在GenBank數據庫中登錄了該病原體的全長序列。但目 前該病尚無有效的防治方法。因此，對該病的檢疫將有助于防止該病 的進一步擴散。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方 法。一種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法，包括以下步驟：

①從待檢測的桑樹的葉片或芽體剪取樣品，提取總RNA得到提 取溶液；

②在所述提取溶液中加入DNA分解酶，待DNA分解后得到總RNA 溶液；

③取總RNA溶液中的溶液，將RNA進行RNA逆轉錄，合成cDNA；

④對合成的cDNA進行PCR擴增；

⑤取擴增的cDNA，在瓊脂糖下電泳，得到提純的cDNA；

⑥將經過步驟⑤得到的cDNA在紫外燈下觀察是否有擴增的 DNA條帶。

作為優選，所述的將RNA進行RNA逆轉錄是由腺苷酸、尿苷酸、 胸腺嘧啶和尿嘧啶隨機組合的長度為6個核苷酸的隨機引物的混合 物為引物。

作為優選，所述步驟④中PCR擴增時使用的引物序列為：引物 1：5’-GTC?CAG?ACA?CAC?ATC?T-3’，引物2：5’-TGA?TGA?GTT?CGA AAG?AAC-3’。

作為優選，所述PCR擴增條件是先于95℃變性5分鐘然后進入 30個PCR的循環，循環結束后，再在72℃條件下保持10分鐘。

作為優選，步驟⑥所述紫外燈觀察在356bp位置進行。

作為優選，步驟①中所述的提取總RNA是以Trizol試劑作為提 取劑提取總RNA。

在瓊脂糖電泳后，如果能在紫外燈下在356bp位置看見擴增的 DNA條帶，則表明該桑樹或苗中攜帶該病原體。如果樣品中存在該分 子，整枝植株應予以銷毀，以防止該病的擴散。

本發明的有益效果在于可通過對該病原體特征序列的擴增來檢 測病原體的存在，一般可在數小時內完成，快速靈敏。

具體實施方式

本具體實施例僅僅是對本發明的解釋，其并不是對本發明的限 制，本領域技術人員在閱讀完本說明書后可以根據需要對本實施例做 出沒有創造性貢獻的修改，但只要在本發明的權利要求范圍內都受到 專利法的保護。

實施例一

一種檢測桑樹花葉萎縮病病原體的方法，包括如下步驟：

①桑樹葉或芽體的總RNA提取：從待檢測的桑樹或桑苗的葉片 或芽體剪取0.5克樣品，以Trizol試劑提取總RNA。在經氯仿提取 除去多余的蛋白質后，在提取溶液中加入DNA分解酶以除去溶液中的 DNA獲得總RNA。

②cDNA的合成：取經步驟①得到的總RNA?0.1～0.5mg，采用 由腺苷酸、尿苷酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶隨機組合的長度為6個核苷酸 的隨機引物的混合物為引物，用RNA逆轉錄酶進行RNA逆轉錄，42℃ 下保持50分鐘，合成cDNA。