[發明專利]一種海洋貝類卵細胞石蠟切片方法

有效

• 申請號: 200910101344.0
• 申請日: 2009-07-30
• 公開（公告）號: CN101650273A
• 公開（公告）日: 2010-02-17
• 發明（設計）人: 董迎輝;林志華
• 申請（專利權）人: 浙江萬里學院
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30;G01N21/84
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司
• 代理人: 袁忠衛

技術領域

本發明涉及到一種石蠟切片的方法，具體講是一種適用于卵徑較小的海洋貝類卵細胞石蠟切片方法。

背景技術

石蠟切片技術是受精細胞學的重要研究手段之一，其技術成熟、方法穩定、造價低廉、觀察方便，且有組織結構保存完好、獲得圖像對比清晰等優點，可在光鏡下清晰地看到受精卵外部形態和內部結構的變化，尤其是紡錘體的消長和兩性原核結合時的核膜變化，具有不同于壓片、透射電鏡和熒光顯微術的獨特優勢。石蠟切片技術已被廣泛用于魚類受精細胞學研究中。然而，由于多數貝類的卵子個體微小，尤其是雙殼貝類，卵徑一般僅幾十微米，如櫛孔扇貝卵徑70μm左右，文蛤80～90μm，菲律賓蛤仔71～85μm，而近江牡蠣、寬殼全海筍的卵徑僅有40～50μm，如此小的卵子，肉眼不易看清，給脫水、透蠟、包埋等過程帶來很大不便。

理論上講，石蠟切片的厚度可達5～8μm，而一個幾十微米的卵子也能被切成數片。只要卵量大、切片和染色效果好，就能找到方向合適的卵子的切面，從而觀察到染色體和紡錘體的變化情況，系統研究不同發育階段的核行為，為受精及早期胚胎發育機理的深入研究和細胞工程育種提供基礎資料。但是，傳統的石蠟切片技術尚未解決卵子小而帶來的諸多困難，所以目前用石蠟切片技術來研究雙殼貝類受精過程的報道很少，而能獲得分裂相清晰、染色效果好的方法介紹還尚未見到。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀，提供一種針對海洋貝類卵細胞相對微小的特點，提供一種分裂相清晰、染色效果好的海洋貝類卵細胞石蠟切片方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：該海洋貝類卵細胞的石蠟切片方法，其特征在于包括下述步驟：

①樣品固定：將不同發育階段的卵細胞連同海水轉移至離心管中，然后緩慢加入冷的Bouin氏液將樣品固定20-40min，待樣品自然沉降或低速離心后，除去上清液，加入新的Bouin氏液，如此更換Bouin氏液2-3次，然后轉移入70％酒精中，置4℃冰箱中保存；

②卵細胞預處理：向盛有卵細胞的離心管中加入幾滴1％的伊紅染液，染色1～2分鐘，使卵細胞表面被染成粉紅色，便于肉眼識別；用細針在稱量紙上刺些小孔，用稱量紙將染色后的卵細胞包起來，以使卵子在處理時不會漏出；

③脫水與透明程序：將用稱量紙包好的卵細胞置于脫水機或染色缸中，用梯度乙醇脫水；先后采用70％乙醇脫水50分鐘、85％乙醇脫水50分鐘2次、95％乙醇脫水45分鐘2次、100％乙醇脫水45分鐘2次；然后用1∶1(體積比)的無水乙醇/二甲苯過渡處理25分鐘，再用二甲苯處理20分鐘2次，使之透明；

④透蠟和包埋：用1∶1(體積比)的二甲苯/石蠟過渡處理40分鐘，52～56℃熔點的石蠟透蠟1小時2次；打開紙包，將卵子置于包埋盒中，使卵子均勻地分布于包埋盒中部，然后加注融蠟進行包埋；

⑤切片和烤片：用生物切片機切片，切片厚度5μm，蠟帶用40℃恒溫水浴展片，貼于事先涂有粘片劑的載玻片上，然后在烤片機上烘干；

⑥染色與封片：染色采用伊紅-蘇木精復染方法，其中用蘇木精染色6～8分鐘，伊紅染色1.5～2分鐘；然后用中性樹膠封片。

上述方法中，所述的Bouin氏液配方可以為：苦味酸飽和液75mL，甲醛25mL，冰醋酸5mL。

所述的蘇木精染液配方可以為：2g蘇木精溶于250mL無水乙醇中，10g硫酸鋁溶于750mL水中，兩液混合，加熱沸騰3分鐘，稍冷卻加入碘酸鈉0.5g，檸檬酸1.0g，溶解后即得到蘇木精染液。

所述的伊紅染液配方可以為：1g伊紅溶于99mL?70％乙醇中。

與現有技術相比較，本發明的優點在于：

1、通過簡單的預染色和紙包處理，克服了海洋貝類卵子微小帶來的操作不便；

2、操作簡單，毋需增加專門的儀器，便于推廣應用；

3、脫水、透明、透蠟程序間均有過渡步驟，程序內多為兩步處理，使試劑逐漸完全地進入組織，完好地保存組織的原有結構；

4、采用改進的伊紅-蘇木精染色，獲得的卵子切片清晰、對比度大，便于觀察。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中文蛤卵子及二細胞期胚胎切片，其中，

A.文蛤成熟未受精卵，示染色體(CHS)、紡錘體(SD)；

B.第二次成熟分裂中期，示第一極體(PB1)；

C.兩性原核形成期，示第二極體(PB2)、雌原核(FPN)、雄原核(MPN)；

D.二細胞期，示卵裂溝(CF)；