[發(fā)明專利]自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)植方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910101280.4
• 申請(qǐng)日: 2009-07-27
• 公開（公告）號(hào): CN101597593A
• 公開（公告）日: 2009-12-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王培科;呂燁;趙可佳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州安倍生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/08
• 分類號(hào): C12N5/08;A01N1/02
• 代理公司: 杭州天欣專利事務(wù)所
• 代理人: 陳 紅

1.一種自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于依次進(jìn)行皮膚標(biāo)本處理步驟和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟，所述皮膚標(biāo)本處理步驟包括：

無菌條件下切取的皮膚標(biāo)本，立即放入裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)液的離心管中封存并運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，置于4℃冰箱中，24小時(shí)內(nèi)處理皮膚標(biāo)本，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液采用DMEM低糖培養(yǎng)液，含重量百分比為20％的胎牛血清，100單位/毫升青霉素和100單位/毫升鏈霉素；

所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟包括原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟，所述原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟包括：

在超凈工作臺(tái)無菌條件下將皮膚標(biāo)本移入3.5cm培養(yǎng)皿中，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗，修剪皮膚標(biāo)本并去除皮下組織、脂肪，剪切皮膚標(biāo)本成1mm³小塊，置小塊皮膚標(biāo)本于50ml培養(yǎng)瓶并使真皮層緊貼培養(yǎng)瓶底部并均勻分布，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使得瓶底朝上，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液2ml并保持基礎(chǔ)培養(yǎng)液與小塊皮膚標(biāo)本不接觸，擰緊瓶塞，將培養(yǎng)瓶倒置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中，1小時(shí)后緩慢將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)讓基礎(chǔ)培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶底上的小塊皮膚標(biāo)本，再倒置培養(yǎng)，2小時(shí)后正放培養(yǎng)瓶，使基礎(chǔ)培養(yǎng)液與小塊皮膚標(biāo)本接觸，每3～5天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)液一次，每次2ml，使得成纖維細(xì)胞大量繁殖。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于：所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟在原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟后還設(shè)有成纖維細(xì)胞傳代步驟，所述成纖維細(xì)胞傳代步驟包括：

吸棄舊培養(yǎng)液，加入2mlPBS溶液，輕輕清洗細(xì)胞后吸棄PBS溶液，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA溶液1ml，將培養(yǎng)瓶置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中消化5分鐘；

以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，立即加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化；

吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底壁；

收集帶有細(xì)胞的含胰蛋白酶溶液于離心管，離心以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，吸棄上清；

用1ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，輕輕吹打均勻后再加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液吹打均勻，將細(xì)胞分裝于3個(gè)新的50ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶2ml；

將培養(yǎng)瓶置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，使原代成纖維細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞并大量增殖。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于：所述成纖維細(xì)胞傳代步驟重復(fù)進(jìn)行，使得成纖維細(xì)胞大量增殖。?

4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一權(quán)利要求所述的自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于：所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟在原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟后或者成纖維細(xì)胞傳代步驟后還設(shè)置有成纖維細(xì)胞凍存步驟，所述成纖維細(xì)胞凍存步驟包括：

吸棄培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA溶液2ml，于37℃，5％C0₂條件下消化3～5分鐘；

以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓形為度，吸去消化液，立即加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止消化；

吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打培養(yǎng)皿底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶底壁；

收集帶細(xì)胞培養(yǎng)液，離心以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，除去上清；

加3～5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，離心以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，除去上清溶液；

加1ml凍存液重懸并吹勻細(xì)胞，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至凍存管，蓋緊密封后，將凍存管封包，所述凍存液包括重量百分比為50％的胎牛血清、10％的DMSO溶液、40％的基礎(chǔ)培養(yǎng)液；

將凍存管儲(chǔ)存到4℃冰箱，2小時(shí)后轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱，再2小時(shí)后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱凍存。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于：所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)步驟在成纖維細(xì)胞凍存步驟后還設(shè)置有成纖維細(xì)胞解凍步驟，所述成纖維細(xì)胞解凍步驟包括：

將含成纖維細(xì)胞的凍存管從-80℃冰箱中取出，直接置于37℃水浴中解凍；

解凍后將凍存管離心以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，除去上清；

加基礎(chǔ)培養(yǎng)液2ml重懸細(xì)胞，離心以1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)6分鐘，除去上清；

加基礎(chǔ)培養(yǎng)液1ml重懸細(xì)胞并吹打均勻，再加基礎(chǔ)培養(yǎng)液1ml并吹勻細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入50ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；

在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～5天更換基礎(chǔ)培養(yǎng)液一次，每次2ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一權(quán)利要求所述的自體組織成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于：所述超凈工作臺(tái)超凈空氣的流速為24～30米/分鐘。?