[發明專利]從非變性聚丙烯酰胺膠中回收和純化DNA片段的方法

有效

• 申請號: 200910100944.5
• 申請日: 2009-08-10
• 公開（公告）號: CN101619311A
• 公開（公告）日: 2010-01-06
• 發明（設計）人: 朱玉君;莊杰云;樊葉楊
• 申請（專利權）人: 中國水稻研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C07H21/04
• 代理公司: 浙江翔隆專利事務所
• 代理人: 沈綠怡

技術領域

本發明涉及一種從非變性聚丙烯酰胺凝膠中回收和純化目標DNA片段的方法。?

背景技術

在分子生物學研究中，常常需要對目標DNA片段進行回收和純化，其主要目的是排除非目標DNA片段。常見的情況有兩種，其一是，DNA擴增反應中往往存在非特異性擴增或多位點擴增，產物中一般會出現一些非目標片段；其二是，對載體及目的DNA片斷酶切后，產物中往往含有目標片段外的多余片斷。因此，在應用目標片段進行進一步實驗前，必須對其進行回收和純化。最常用的方法是，應用凝膠電泳分離DNA樣品，顯色后切取目標條帶，釋放DNA，通過酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收。?

應用凝膠電泳回收DNA片段，可采用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠，其中，基于瓊脂糖凝膠的回收和純化方法較多且較成熟，但瓊脂糖凝膠電泳的分辨率較低，一般只適用于分離0.5~25kb的DNA片段；對于分子量較小的DNA片段，需要采用分辨率較高的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳。兩種方法的基本差異表現在切下目標條帶后DNA的釋放，其后可采用相同的步驟，而DNA從凝膠中的釋放，正是應用PAGE回收DNA的主要難點。?

DNA難以從PAGE膠中釋放出來，是由丙烯酰胺的一些特性造成的。無論是采用變性PAGE膠，還是非變性PAGE膠，丙烯酰胺以C-C鍵聚合，聚合后很難解聚，在高溫下又不會像瓊脂糖一樣熔化；同時，在常規實驗中，PAGE膠濃度一般為6-10％，其分子結構非常緊密，不利于DNA釋放。目前通常的做法是，采用無菌槍頭將切取的PAGE膠搗碎，放置在低溫環境中過夜浸泡，收集上清液，用冰乙醇沉淀純化。但是，用無菌槍頭搗碎膠，既費時，膠的破碎度也不夠，導致DNA釋放量低；為了提高膠的回收率，需要浸泡過夜，會導致DNA的降解。?

本發明克服了以往方法中碎膠程度不夠、操作步驟繁瑣，實驗過程耗時長、回收量低的缺點，能夠在2小時內從銀染后的非變性PAGE膠中獲得純化后的目標DNA片段，且成本低、質量高。?

發明內容

本發明的目的是提供一種從非變性PAGE膠中回收和純化目標DNA片段的有效方法。?

本發明是通過如下技術方案來實現的：?

1.樣品清洗：從染色顯帶后的非變性PAGE膠中切下目標DNA片段，置于稱量皿中，加入雙蒸水ddH₂O洗滌。?

2.樣品研磨：將洗滌后的膠條移入無菌離心管，利用組織研磨儀將其充分打碎。?

3.樣品浸泡：加入分散緩沖液[0.5M醋酸銨，0.01M醋酸鎂，1mM?EDTA(pH8.0)，0.1％SDS]，混勻，60℃溫浴1小時。?

4.凝膠去除：加入與上述分散緩沖液等體積的氯仿抽提液，離心，吸取上清液，移入新的無菌離心管中。?

5.乙醇沉淀：加入上述上清液2倍體積的冰乙醇，混勻，靜置10分鐘，離心，棄上清液，經75％乙醇清洗后，倒置干燥。?

6.DNA溶解：加入1×TE緩沖液，溶解，取微量樣品檢測其質量，其余樣品保存于-20℃待用。?

本發明利用組織研磨儀充分打碎含目標DNA片段的膠條、通過分散緩沖液浸泡碎膠，氯仿抽提上清液和酒精沉淀DNA溶液，達到快速、高效回收和純化目標DNA片段的目的。采用本發明，可在2小時內從銀染后的非變性PAGE膠中獲得純化后的目標DNA片段。?

附圖說明

圖1A為水稻微衛星標記RM19座位上7個等位基因的普通模版擴增檢測結果；?

圖1B為水稻微衛星標記RM19座位上7個等位基因的回收純化后重新擴增檢測結果。?

具體實施方式

如圖1A、圖1B，圖中M：分子量標記；1、2、3、4、5、6、7分別表示7?個不同的等位基因。?

實施例：水稻微衛星標記RM19的7個等位基因DNA片段的回收與純化。?

水稻微衛星標記RM19曾在我國主栽水稻親本中檢測到7個不同的等位基因，但存在明顯的非特異片段(圖1A)。根據上述發明技術、采用下述步驟對各個片段進行了純化。?

1.聚合酶鏈式反應(PCR)擴增?

采用50μl反應體系，每個等位基因擴增5份，擴增反應在PCR儀上進行。?