[發明專利]D-丙氨酸的生物法制備技術

無效

• 申請號: 200910100795.2
• 申請日: 2009-07-23
• 公開（公告）號: CN101649344A
• 公開（公告）日: 2010-02-17
• 發明（設計）人: 李加友
• 申請（專利權）人: 嘉興學院
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P13/06;C12R1/425;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于酶工程領域，涉及一種氨基酸的生物轉化方法，尤其涉及一種利用微生物細胞轉化D，L-丙氨酸外消旋體系中的L-丙氨酸以制備D-丙氨酸的方法，更具體的涉及一種利用L-丙氨酸脫氨酶的高度專一性，將菌體胞內的L-丙氨酸分解為氨和丙酮酸，并得到D-丙氨酸的方法。

背景技術

丙氨酸是構成蛋白質的20種基本氨基酸之一，是血中氮的優良運輸工具，又是一種有效的生糖氨基酸。D-丙氨酸是丙氨酸的一種立體構型，為非天然的氨基酸，不是蛋白質組成氨基酸和人體正常代謝氨基酸，現代研究表明，在醫藥、食品、化妝品等領域有重要用途。

在醫藥方面，D-丙氨酸是生產維生素B6的原料，有鎮痛作用，它還可以做成輸液注射、單劑或合劑(氨基酸的應用[J]，1996，154)。在法國，D-丙氨酸被用做防止顏面潮紅的藥物。近年的研究還發現D-丙氨酸具有其他生理活性方面的應用。D-丙氨酸可使體內氨基酸氧化酶(DAAO)在腫瘤細胞質中異位表達，阻止體內脂質氧化損傷，清除細胞毒性(遼寧化工[J]，2003，2，58-60)。D-丙氨酸還可以抑制致二甲基亞硝胺(DMNA)的致癌作用，有效抑制率為72.4％。具有伯胺基的D-丙氨酸能競爭性地替代仲胺與亞硝酸鹽生成VAN?Slyke反應，分解為氮氣和有機酸，從而抑制了DMNA的生成。因此D-丙氨酸可以應用于腫瘤的預防。

在食品方面，D-丙氨酸具有丙氨酸的一些共性，即在食品添加劑方面的應用，主要供增味劑和調味料用，增加化學調味料的調味效果，改善人工甜味劑的味感，改善有機酸的酸味。另外，D-丙氨酸本身具有自己的特性，可以應用在功能性食用甜味劑方面。D-丙氨酸甜度高、安全、無熱量，既適合普通人群消費，更適合肥胖和糖尿病人消費。D-丙氨酸是合成二肽甜味劑L-天冬氨酸-D-丙氨酸的原料之一(JP5276965)。

在化妝品方面，D-丙氨酸有抑菌作用，而且是自然保濕因子的主要成分，是角質層保持水分的重要角色。

目前D-丙氨酸的制備方法主要有生物法和化學法。

D-丙氨酸的化學法制備有兩種，一種是利用不對稱合成法直接得到D-丙氨酸，另一種是通過化學合成法得到DL-丙氨酸的混旋體，再利用各種光學拆分方法制備D-丙氨酸。

Yanakada在培養基中添加聚乙二醇，在30℃培養D-環絲氨酸抗性的短桿菌(乳酸發酵短桿菌DCSR-26)72h，可得高光學純度D-丙氨酸(JP5276965)；Takeuchi等人報道用Brevibacterium?lactofementum的抗D-環絲氨酸的突變株來發酵生成D-丙氨酸的研究，但由于丙氨酸消旋酶的作用，所得到的D-丙氨酸的光學純度很低(EP0310949)。Yamada等人篩選出一株氯代D-丙氨酸抗性菌(乳酸發酵短桿菌HR5-43)，在950mL培養基中添加葡萄糖、生物素、維生素B、磷酸鹽等，在pH6.0-8.0下發酵72h可得19.1g的D-丙氨酸，其光學純度可達99％(JP5308981)。

Noriko?Ito等利用Candida、Cryptococcus、Hansenura和Trichosporon同化L-丙氨酸而對D-丙氨酸不起作用的特點，開發了不對稱降解DL-丙氨酸生物法制備D-丙氨酸的新工藝(US5,422,255)。

通過比較生物法和化學法發現，化學法生產D-丙氨酸污染大，效率低，光學純度不高，并且設備費用昂貴。而發酵法菌種的篩選工作比較困難，發酵周期長，能耗高，產物濃度低，提取困難。而利用生物法對DL-丙氨酸外消旋體系中L-丙氨酸的高效轉化制備D-丙氨酸，其工藝條件溫和，無需高溫高壓，環境友好，且底物轉化率和光學純度都很高，成本較低，有重要的產業化應用前景。

發明內容

本發明的目的是提供一種D-丙氨酸的生物法制備技術，利用微生物細胞中的L-丙氨酸脫氨酶將菌體胞內的L-丙氨酸分解為氨和丙酮酸，從而實現制備D-丙氨酸的方法。

本發明的另一個目的是提供一種L-丙氨酸的高效轉化菌株合適培養方法。

本發明所述的用于L-丙氨酸轉化的菌株為糞腸球菌(Enterococcus?faecalis)、格氏沙雷氏菌(Serratia?grimesii)或其混合。