[發明專利]一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法

有效

• 申請號: 200910100616.5
• 申請日: 2009-07-13
• 公開（公告）號: CN101603048A
• 公開（公告）日: 2009-12-16
• 發明（設計）人: 謝雪欽;馮明光
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/74;C12N9/02;C12R1/19
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司
• 代理人: 劉曉春

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核 表達方法。

背景技術

超氧化物歧化酶(Superoxide?Dismutase，簡稱SOD；EC?1.15.1.1)系一類金屬抗 氧化酶，廣泛存在于生物體中，它能夠催化超氧陰離子(O^2-)發生歧化反應，從而 清除自由基，在生物體防御氧化損傷的過程中發揮著重要作用(Fridovich?I.1995. Superoxide?radical?and?superoxide?dismutases.Annu?Rev?Biochem?64：97-112.)。根據酶 分子中所含金屬輔基的不同，SOD主要可分為Cu/Zn-SOD(多存在于真核生物)、 Mn-SOD(多存在于原核細胞和真核細胞線粒體)和Fe-SOD(存在于原核細胞和高等 植物葉綠體)等類型。SOD作為自由基清除劑，已被廣泛應用于醫藥、食品和日用 化妝品等各個領域(方允中，李文杰。自由基與酶。科學出版社，1989)。在醫藥 上，SOD可用于治療氧中毒、糖尿病、輕度燒傷及多種炎癥等，在臨床上都有較好 的效果。在食品工業上，由于SOD無毒，無副作用，可作為食品添加劑用于飲料、 口香糖及保健食品的生產。此外，在化妝品中添加SOD，可起到防止皮膚衰老和治 療皮膚疾病的作用。

現在市售的SOD多數為從哺乳動物牛、豬等動物肝臟中提取，隨著瘋牛病、 口蹄疫、禽流感、豬流感等流行，安全性問題日漸凸顯。另外，傳統的提取方法還 存在原料有限、分離純化困難、產量低等缺陷。因此，利用基因工程技術構建工程 菌株以實現SOD的高效、廉價化生產和制備無疑成為SOD規模化生產的有效途徑。 相對于酵母、昆蟲細胞等眾多外源表達系統，大腸桿菌由于具有生長速度快、培養 基廉價、技術方案簡單可行、載體及受體菌株多元化等優勢而成為理想的基因工程 受體菌。

真核生物一般具有Cu/Zn-型和Mn-型兩類SOD，其中多數的Cu/Zn-SOD都需 要專一的分子伴侶CCS來傳遞金屬輔基Cu²⁺并催化分子間二硫鍵的形成而實現酶 的轉錄后激活。研究表明釀酒酵母CCS基因Lys7缺失突變株的Cu/Zn-SOD表達量 不變，但不具備清除氧自由基的活性(Culotta?VC，Klomp?LWJ，Strain?J，Casareno?RLB， Krems?B，Gitlin?JD.1997.The?copper?chaperone?for?superoxide?dismutase.J?Biol?Chem 272：23469-23472)。真核生物Cu/Zn-SOD對專一分子伴侶的普遍依賴性無疑成為此 類活性蛋白在缺乏CCS的原核表達體系中實現高效表達的最大瓶頸。但是據報道， 在少數真核生物中仍存在不依賴于專一性分子伴侶CCS的Cu/Zn-SOD激活途徑。 如人源的Cu/Zn-SOD(hSOD)在在缺失分子伴侶的情況下仍具有一定活性(Carroll MC，Girouard?JB，Ulloa?JL，Subramaniam?JR，Wong?PC，Valentine?JS，Culotta?VC.2004. Mechanisms?for?activating?Cu?and?Zn-containing?superoxide?dismutase?in?the?absence?of the?CCS?Cu?chaperone.Proc?Natl?Acad?Sci?USA，101：5964-5969)；秀麗廣桿線蟲 Caenorhabditis?elegans的SOD(CeSOD)激活則完全不需要伴侶(Jensen?LT，Culotta VC.2005.Activation?of?CuZn?superoxide?dismutases?from?Caenorhabditis?elegans?does not?require?the?copper?chaperone?CCS.J?Biol?Chem?280：41373-41379)。通過三者序列 比對推測，釀酒酵母SOD對CCS的完全依賴性可能與其C末端存在的兩個脯氨酸 有關。將hSOD(Carroll?et?al.，2004)和CeSOD(Jensen?et?al.，2005)中相應位點的氨基 酸突變為脯氨酸后，這兩種酶在CCS缺失條件下亦失活。這一現象為我們改造真核 生物Cu/Zn-SOD，克服其對專一分子伴侶的依賴性，實現此類SOD在E.Coli體系 中的規模化生產提供了思路，但迄今這一技術路線未見在真菌中成功實施的案例。