[發明專利]一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法

有效

• 申請號: 200910100616.5
• 申請日: 2009-07-13
• 公開（公告）號: CN101603048A
• 公開（公告）日: 2009-12-16
• 發明（設計）人: 謝雪欽;馮明光
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/74;C12N9/02;C12R1/19
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司
• 代理人: 劉曉春

1.一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法，其特征在于它包括 對BbSod1基因的克隆，在獲得BbSod1基因的基礎上構建重組質粒 pET-BbSod1-Mut，然后對重組質粒進行擴增及蛋白表達；

所述BbSod1基因的編碼區對應的DNA序列為序列表中的第8個序列中的外 顯子區；

所述BbSod1基因的克隆包括對BbSod1保守區序列的克隆，在BbSod1保守 區序列的基礎上獲得BbSod1編碼區序列，然后在BbSod1編碼區序列的基礎上 再獲得BbSod1cDNA編碼區序列；

所述原核表達載體pET-BbSod1-Mut的構建是將BbSod1編碼蛋白C末端的 第143位的脯氨酸突變為絲氨酸，第145位的脯氨酸突變為亮氨酸，突變后的基 因BbSod1-Mut經限制性酶酶切后插入原核表達載體中得到；

所述BbSod1保守區序列克隆的簡并引物序列為：

正向引物：5′-GACAAYACCAACGGCTGCAC-3′，

反向引物：5′-GGYACYGAYGAYCTYGG-3′；

所述BbSod1保守區序列以球孢白僵菌Bb2860(Beauveria?bassiana(Balsamo) VueUemin)基因組為模板擴增得到；

所述BbSod1編碼區的引物序列為：

正向引物：5′-GGAATTCCATATGGTCAAAGCAGTCTGTGTCC-3′，

反向引物：5′-CCCAAGCTTGTTGGCAACGCCAATGACACC-3′；

用于定點突變BbSod1的引物為：

正向引物：5′-GGAATTCCATATGGTCAAAGCAGTCTGTGTCC-3′，

反向引物：

5’-CCCAAGCTTGTTGGCAACGCCAATGACACCGCAGGCGAGGCGAGA TCCAGCG-3’；

所述編碼區引物的擴增模板為球孢子白僵菌(Beauveria?bassiana)2860菌株 總RNA逆轉錄所得的cDNA。

2.如權利要求1所述的一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方 法，其特征在于所述重組質粒pET-BbSod1-Mut的基因BbSod1-Mut經限制性內 切酶NdeI和HindIII消化后插入到原核表達載體。

3.如權利要求1所述的一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方 法，其特征在于所述蛋白表達的誘導條件為20℃和150r/min振蕩誘導過夜。

4.如權利要求1所述的一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方 法，其特征在于所述蛋白表達的誘導時加入的IPTG、Cu²⁺和Zn²⁺離子濃度分 別為0.5mM、2.5mM和0.5mM。