[發(fā)明專(zhuān)利]三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910099604.5
• 申請(qǐng)日: 2009-06-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101565718A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 錢(qián)程;劉立;張磊;楊智
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江理工大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/861
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/861;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 杭州求是專(zhuān)利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 周 烽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因治療領(lǐng)域，特別涉及一種利用人5型腺病毒(Ad5)骨架來(lái)嵌合人11型腺病毒(Ad11)纖維蛋白(fiber)的三靶向嵌合型溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法及攜帶所有具有殺傷、抑制癌癥的外源基因如IL-24、TRAIL、SOCS3、cpp-SOCS3、SOCS1和cpp-SOCS1的應(yīng)用。

背景技術(shù)

惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，目前臨床上對(duì)絕大多數(shù)晚期腫瘤患者仍然缺乏有效的治療手段。當(dāng)細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)理論與技術(shù)得到飛速發(fā)展，基因治療腫瘤策略應(yīng)運(yùn)而生。而隨著病毒學(xué)和腫瘤學(xué)快速發(fā)展，人們又嘗試將改造后的病毒用于腫瘤治療的研究工作。

癌癥的靶向基因一病毒治療策略是利用溶瘤病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性裂解、增殖來(lái)提高抗癌基因?qū)Π┘?xì)胞的強(qiáng)烈殺傷作用或抑制作用。這與傳統(tǒng)腫瘤基因治療的病毒載體有本質(zhì)上的不同，后者是一種非復(fù)制性病毒，僅僅作為運(yùn)載工具將抗癌基因運(yùn)輸?shù)浇M織或細(xì)胞內(nèi)，而載體本身無(wú)靶向性和復(fù)制能力也無(wú)治療作用。靶向基因一病毒治療充分利用病毒體積小、能復(fù)制和擴(kuò)散能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可在腫瘤原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移灶局部形成高濃度病毒，并激發(fā)免疫系統(tǒng)應(yīng)答來(lái)增強(qiáng)殺瘤效應(yīng)；同時(shí)還可以將抗癌基因靶向地運(yùn)至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，抗癌基因能隨著病毒的復(fù)制而增加拷貝數(shù)，提高抗癌基因的表達(dá)量，兩者協(xié)同作用從而進(jìn)一步提高抗腫瘤的療

目前作為基因治療的載體分為病毒型和非病毒型兩大類(lèi)。病毒載體包括：腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、和皰疹病毒等。病毒載體轉(zhuǎn)染率高，表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)，但免疫原性強(qiáng)，有一定危險(xiǎn)性。非病毒載體包括：裸露DNA、脂質(zhì)體和其它物質(zhì)包裹的DNA。非病毒載體則免疫原性小及安全性好，但轉(zhuǎn)染率低，基因穩(wěn)定性差，表達(dá)時(shí)間短。目前使用最多還是病毒載體。而在眾多病毒載體中腺病毒以其宿主范圍廣，致病性低，包裝容量大，產(chǎn)生滴度高等優(yōu)點(diǎn)成為應(yīng)用最廣的基因治療載體。根據(jù)http://www.wiley.co.uk/genmed的最新統(tǒng)計(jì)，全球共有1145個(gè)基因治療方案進(jìn)入臨床，其中67％用于癌癥的治療，而以腺病毒為載體的研究最為廣泛且高達(dá)25％。

而關(guān)于5型腺病毒(Ad5)的研究已經(jīng)進(jìn)行了很長(zhǎng)的時(shí)間，對(duì)其所具有的特點(diǎn)及安全性均一定的了解和認(rèn)識(shí)，目前腺病毒基因治療仍以Ad5為主導(dǎo)。由于Ad5對(duì)細(xì)胞的感染效率高度依賴(lài)于細(xì)胞表面柯薩奇病毒和腺病毒受體(coxsakieand?adenovirus?receptor，CAR)的表達(dá)水平，但在近50％的上皮細(xì)胞源性的腫瘤細(xì)胞表面CAR非常缺乏，甚至在血液腫瘤細(xì)胞表面幾乎不表達(dá)，這就使得腺病毒對(duì)這些腫瘤細(xì)胞感染效率低下，甚至對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤無(wú)感染能力。這一特性限制了其在上皮細(xì)胞源性的腫瘤細(xì)胞和血液腫瘤細(xì)胞的治療中的應(yīng)用。因此再此基礎(chǔ)上研制高效、靶向轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的載體系統(tǒng)對(duì)目前腫瘤的基因治療至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11載體的構(gòu)建方法，該方法是以雙靶向溶瘤腺病毒載體pCN103和pCN205做為基礎(chǔ)，通過(guò)將5型腺病毒Ad5的骨架與人11型腺病毒Ad11的纖維蛋白fiber進(jìn)行嵌合并利用端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控缺失了CR2區(qū)與Rb蛋白結(jié)合所必需的24bp的E1A基因。

進(jìn)一步地，該方法具體包括以下步驟：

(1)通過(guò)PCR的方法，將人11型腺病毒的Fiber基因裝載于穿梭質(zhì)粒p11zf-ad5-ad11p。

(2)通過(guò)同源重組的方法將人11型病毒Fiber基因替換pCN103骨架質(zhì)粒中的5型病毒Fiber基因。

(3)用酶切連接的方法構(gòu)建E3區(qū)缺失6.7K和gp19K基因的載體質(zhì)粒pCN204；

(4)將所有具有殺傷和抑制各類(lèi)癌癥的外源基因如IL-24、TRAIL、SOCS3、cpp-SOCS3、SOCS1和cpp-SOCS1克隆進(jìn)pCN204的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成質(zhì)粒pCN204-IL-24。

(5)將質(zhì)粒pCZ204-IL-24通過(guò)酶切和片段回收后，電轉(zhuǎn)化在BJ5183同源重組，獲得三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11載體，命名為pCN205-11p載體。