[發明專利]傳染性脾腎壞死病毒的LAMP-LFD檢測方法

無效

• 申請號: 200910099587.5
• 申請日: 2009-06-12
• 公開（公告）號: CN101624636A
• 公開（公告）日: 2010-01-13
• 發明（設計）人: 陳炯;李明云;史雨紅;丁文超
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所（普通合伙）
• 代理人: 程曉明

技術領域

本發明涉及傳染性脾腎壞死病毒的檢測方法，具體涉及傳染性脾腎壞死病毒的LAMP-LFD檢測方法。?

背景技術

虹彩病毒是一類對魚類、兩棲類和爬行類水生動物具有廣泛感染性的致病病原，由其感染所致的疾病已成為世界水產養殖業的嚴重問題。根據國際病毒分類委員會(International?Committee?On?Taxonomy?of?Viruses，ICTV)第八個病毒報告，傳染性脾腎壞死病毒(Infectious?spleen?and?kidney?necrosis?virus，ISKNV)為虹彩病毒科細胞腫大病毒屬代表種，是大型二十面體細胞質型線性雙鏈DNA病毒，直徑大小約為150nm。它能引起全身性、系統性地感染，對感病魚的脾臟、腎臟等造血器官和組織造成嚴重破壞，導致病魚貧血、多器官衰竭而死亡。ISKNV是許多重要養殖魚類如鱖魚、花鱸、大黃魚及重要的觀賞魚類如藍眼燈和麗麗魚等的爆發性流行病的病原，這類病毒侵染魚體流行快，極易引起魚的暴發性死亡，給我國水產養殖業造成巨大經濟損失。因此快速、準確、靈敏的檢測ISKNV的新技術，對控制早期病毒感染、切斷病毒傳播，保障我國魚類水產養殖業的健康持續發展具有重要意義。?

目前公開的ISKNV檢測方法的是采用PCR檢測體系，實現了實驗室條件下對ISKNV的簡便、快速、敏感、特異檢測。如授權公告號為CN11864359C，公告日為2005年1月26日，發明名稱為鱖魚傳染性脾腎壞死病毒基因診斷試劑盒及檢測方法，就公開了設計有二對引物的PCR反應液對樣品模板進行PCR擴增反應檢測。但PCR檢測需要昂貴的PCR儀、凝膠電泳和成像系統(紫外儀)以及分子生物學專業實驗人員操作，這只能在實驗室條件下才可以檢測，限制了PCR檢測方法在生產中的推廣應用。?

環介導恒溫擴增技術(loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)是日本學者Notomi(2000年)發明的一種新式恒溫核酸擴增技術。反應采用能特異識別靶序列上6個位點的4條引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst?DNA?polymerase)，在恒溫條件下(65℃左右)高效(30min～1h)擴增目標DNA。LAMP產物的檢測一般采用瓊脂糖凝膠電泳、濁度觀察、熒光染料目測觀察等方法。?

橫向流動試紙條(lateral?flow?dipstick，LFD)是一種新的檢測方法，反應中FITC標記的探針與生物素標記的LAMP擴增產物特異性雜交，避免了瓊脂糖凝膠電泳或熒光染料染色肉眼觀察由非特異性擴增造成的假陽性，進一步提高了反應的特異性和靈敏?度。LFD檢測無許特殊的設備，操作者只需將產物和試紙條浸入緩沖液，并且不需EB等有毒試劑，操作簡便且更安全。LAMP-LFD結合技術的檢測結果可以直接肉眼觀察。LFD試紙條上具有控制帶和檢測帶，兩條帶均顯色表示檢測結果為陽性，只有控制帶顯色檢測帶不顯色表明檢測結果為陰性。LAMP-LFD結合方法安全、快捷、高效、高靈敏度且無設備及技術限制，具有其他技術所無法替代的優勢。目前，該技術已被用于桃拉病毒(Taura?syndrome?virus，TSV)(Kiatpathomchai?et?al.，2008)，對蝦白斑癥病毒(White?spot?syndrome?virus，WSSV)(Kiatpathomchai?et?al.，2008)，傳染性肌肉壞死病毒(Infectious?myonecrosis?virus，IMNV)(Puthawibool?et?al.，2008)的檢測，傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)的檢測未見報道。本發明第一次將LAMP技術和LFD技術結合并用于傳染性脾腎壞死病毒的檢測。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種應用環介導恒溫擴增技術結合色譜橫向流動試紙條檢測傳染性脾腎壞死病毒的方法，以實現對傳染性脾腎壞死病毒進行快速、安全、特異、靈敏、簡便的現場檢測，克服已有用PCR檢測傳染性脾腎壞死病毒不能在生產中應用的問題。?