[發明專利]傳染性脾腎壞死病毒的LAMP-LFD檢測方法

無效

• 申請號: 200910099587.5
• 申請日: 2009-06-12
• 公開（公告）號: CN101624636A
• 公開（公告）日: 2010-01-13
• 發明（設計）人: 陳炯;李明云;史雨紅;丁文超
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所（普通合伙）
• 代理人: 程曉明

1.非診斷目的的傳染性脾腎壞死病毒的LAMP-LFD檢測方法，其特征在于包括下 述步驟：

(1)DPOL基因純化克隆和測序：將ISKNV的DNA聚合酶基因純化克隆至pMD19-T 得到重組質粒并進行ISKNV-DPOL基因測序分析，測得的ISKNV-DPOL基因的核苷酸序 列如下：

1????ATGGATAGTG?TGTACATCTA?TCAGTGGCTC?TATGCTAACT?ATGAGGTGCG

51???TGGCTACGGC?ATAGCCCCAA?ACAACACTGT?AGTGTGTGTT?CGTGTGCCCA

101??ACTTTAAGCA?AGTGGTGTAT?GTCGAATGCA?CCGACCCACA?ACAGCATGAC

151??CCACGTTCCA?CATTCACCCA?GCACGGGTTC?AGGGTCTATG?AGACGCCCCG

201??GGCGTGTAGC?CTGTATGGCG?CAAAGGGGGT?GGGCACATAC?TTTGCCGCAC

251??GCGTGCCCAA?CTACAATGCC?ATGCGCGATG?TACAGGAGAC?ACAGGGTGCA

301??TTTAAGATAC?ATGAGTCGCG?TGTTAGCAAG?ACGATGGAGT?TCACAGCACG

351??CGCCGGCCTG?CCGACCGTTG?GCTGGATACA?GGTGTCGCAG?CGATGTGTGG

401??TGACGCGCAC?TGTAACAATG?GCAGCCAAAG?AGTACATGGT?GCCTAACTGG

451??CGTACCGATG?TCAGGCCGGC?CCCGGACATG?GAGGGCGTGC?CGCCGGCAAA

501??GATTGTTTAC?TTTGACATTG?AGGTCAAGTC?CGACCATGAA?AACGTGTTCC

551??CCAGTGACAG?GGACGACGAG?GTGATATTTC?AGATAGGCCT?GGTGCTGTGT

601??AGTGGCAACA?CGGTGCTGCG?CACTGACCTT?CTCTCCTTGC?CCGGCCGCGA

651??TTACGACGAC?TCTGTGTACC?AGTACGCCAC?AGAAGGCGAG?CTGCTGCACG

701??CATTCATAGC?CTACATCAGG?GAACACGAGG?TGGTGGCTGT?GTGTGGCTAC

751??AACATCATGG?GCTTTGACAT?ACCGTACATT?ATCAAGAGGT?GCGCACGCAC

801??CTCCATGCTG?GGCACCCTCA?GGCGCATCGG?CTTTGATAAC?CGCAGGCTGG

851??CCATAGAGAA?GACGGCCGGT?GTCGGCTACG?CAAAGATGAC?ATACATACAA

901??TGGGAAGGCG?TCTTGACAAT?AGATCTGATG?CCCATTATCA?TGATGGATCA

951??CAAGCTCGAC?TCGTACAGCC?TGGACTATGT?GGCCAACCAC?TTTGTCAAGG

1001?CGGGCAAGGA?CCCCATTCGC?CCCAGGGACA?TCTTTCACGC?CTATAACACG

1051?GGCATGATGG?CACGCGTGGG?GCGCTACTGT?GTGAAGGACA?CGCAGCTGTG

1101?CAAGCAACTG?GTCGACTACC?TCAATACGTG?GGTGGCGCTG?TGCGAGATGG

1151?CCGGCGTGTG?TAACACATCC?ATTATGCAAC?TGTTTACCCA?GGGCCAGCAG

1201?GTCCGGGTGT?TTGCGCAGAT?CTATCGTGAC?TGCACGCCAA?TGGACGTGGT

1251?CGACAAGGTG?TATGTCATTC?CGGATGGTGG?CTGTGACTCG?GATGTGGTGT

1301?CCCCTTCGTC?ATATACGGGC?GCATATGTGT?ATGAGCCGGT?GCCCGGCGTG

1351?TACAAGAACG?TGATACCCAT?GGACTTCCAG?AGCCTGTATC?CGAGCATCAT

1401?CATATCCAAG?AACATATGCT?ACAGCACCTT?GGTGGACCAG?GGCGGCGAAG

1451?AGTATGCGTG?GCAAGAGCAC?GAAGGCTGCG?AGCACGACCC?GCAGTATGCA

1501?AAACAACACG?CCCTTGGCAT?CGAGATTGGT?GTCTTGCAAT?GCAACATGGC

1551?AGCGCTTCCG?CGACGCGCCA?CCCAAGAGCG?GGCCAGGCTG?CGTGAGCGCA

1601?TAGCAGACAT?GAAGATCCAG?TATGCTAGCA?TGACACCTGC?GGCAGTCAAG

1651?TGTAACGTCT?TCAGCTTCAG?GTTCACGCAT?GCTCACGAAG?GCGTGCTGCC

1701?ACGTGTGCTC?CGTAACCTGC?TGGAGAGCAG?GGCCCGCATA?CGGGCGCGCA

1751?TCAAGACCAC?AGACGACCCC?GACATTAGGG?CAGTTCTGGA?CAAGAGGCAG

1801?CTGGCGTACA?AGATAAGCGC?CAACTCGGTG?TACGGCACCA?TGGGCACGCA

1851?GAGGGGCTAC?CTGCCGTTTA?TGGCGGGGGC?AATGACGACG?ACGTACTGTG

1901?GCCGCAAGCT?GATTGAGAAG?GCCGCTCATC?TCCTTAAGAC?GGTGGTGGGC

1951?GCTACCATTG?TGTACGGCGA?CACCGACTCG?TGCTACATAC?AGCTGGGCCA

2001?CGACCGCGCA?TCACTCGATG?AACTGTGGCA?GATGGCCGTG?AACGCCAGCG

2051?ACACCGTGTC?GGCCTTCTTT?GAGCGCCCGG?TGCGCCTCGA?GTTTGAGCAG

2101?TGCATCTACA?CCAAGTTTAT?CATCTTCACC?AAGAAACGTT?ATGTGTACAG

2151?GGCATTCACA?CGCGACGGCA?AGCAGCGAAC?AGGCAGCAAG?GGTGTGATGC

2201?TGTCCAGACG?CGACAGCGCC?ATGTGTGCCA?GAAACACGTA?TGCGGCAATC

2251?ATGAACACGA?TCCTTGAGGG?ATCTGCAGAT?GTGCCGTTCA?TTGCCGCGTG

2301?CATGATGCAC?GACATGATGA?TACCGGGAGC?GCTTCAAGAC?GACGACTTTG

2351?TGCTGACAAA?GAGTGTGCAG?GACATTGGCA?ATGGGGACGA?TAACAACCAG

2401?GGCTCGTACA?AAGTCAGGAA?TCCACAGAAG?GCGCAGGCGG?CGGCCACCCA

2451?AAGGGTAGCC?CCGGACGATG?CCGAAGGGTA?CGCCATCGCG?CTGCGGCAGG

2501?AAATGGTGAA?GCAGATGCCT?GCGCAGGCAC?AATTGGCAGA?GCGCATGAGA

2551?CTGCAGGGCC?GCGCCGTGGT?CAGTGGCGCT?CGCATCGAGT?ATGTCGTTCT

2601?TAAGCACCAA?TATGGTGTGC?CTGAGGGCGC?CCTGGGGGCA?AGGCTGTTGG

2651?ATTTTGAGCG?GTGGCGCGAA?ATGAAGGTGG?CCTATCCACT?GGATCGGCTG

2701?TACTACATGA?AAAGTGTGGT?CAACGCATGC?GACCAGCTAC?TTGTTACGGC

2751?CGGCTACGGG?CCCGTGTGCA?GCAAGGTATA?TGCGGCGCAC?TTACAGTTGG

2801?CGTACGTGCA?CAAACAGTTA?CTGAGACGCA?CGACGCCTGC?CGTATGA

(2)設計LAMP的引物和探針：根據上述測序得到的ISKNV-DPOL基因的核苷 酸序列進行設計下述LAMP的三對引物序列和一條探針序列：

BIP引物：5’-CATTGGCAAT?GGGGACGATA?ACTTTTGCCT?TCTGTGGATT?CCTGA-3’45

FIP引物：5’-CACGCGGCAA?TGAACGGCAC?ATTTTGCCAG?AAACACGTAT?GCGGC-3’45

B3引物：5’-GCTACCCTTT?GGGTGGC-3’17

F3引物：5’-GACGCGACAG?CGCCATGT-3’18

LF引物：5’-TCTGCAGATC?CCTCAAGGAT-3’20

LB引物：5’-AACCAGGGCT?CGTACAAAGT-3’20

FITC-Probe探針：5’-GATGCACGAC?ATGATGATAC?C-3’21

其中FIP為5’端生物素標記引物，FITC-Probe為5’端FITC標記探針；

(3)配制LAMP反應體系：反應體系的終濃度分別為：外引物F3和B3各0.2 μmol/L，內引物FIP和BIP各1.6μmol/L，環引物LF和LB各0.4μmol/L，dNTPs 0.96mmol/L，pH?8.8的Tris-HCl?20mmol/L，KCl?10mmol/L，MgSO₄6.5mmol/L， (NH4)₂SO410mmol/L，0.1％Triton?x-100，8U?Bst?DNA聚合酶大片段和1μL樣品模 板，加雙蒸水使反應體系總體積為25μL；

(4)LAMP反應體系擴增：將上述反應體系進行擴增反應，擴增反應溫度為61-65 ℃，擴增反應時間為10-60min；

(5)探針雜交和LFD檢測：擴增后將20pmol的FITC-probe探針加入反應體系 中，63℃溫育5min，進行雜交，取8μL雜交液加入100μL緩沖液中混勻，然后將 LFD試紙條浸入取出的雜交液顯色檢測，判斷橫向流動試紙條檢測LAMP的結果。

2.如權利要求1所述的非診斷目的的傳染性脾腎壞死病毒的LAMP-LFD檢測方法， 其特征在于步驟4中所述的擴增反應溫度為65℃，擴增反應時間為20min。