[發(fā)明專利]棉粕發(fā)酵樣品微生物總DNA的提取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910099538.1
• 申請日: 2009-06-18
• 公開（公告）號: CN101591651A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發(fā)明（設計）人: 王新;湯江武;姚曉紅;吳逸飛
• 申請（專利權）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C07H21/04
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司
• 代理人: 沈伾伾

技術領域

本發(fā)明涉及生物基因工程技術領域，具體涉及棉粕發(fā)酵樣品中微生物總DNA的提取方法。

背景技術

棉粕是提取棉籽油后的副產(chǎn)品，一般含有33％～42％的粗蛋白質(zhì)，是產(chǎn)量僅次于豆粕的植物蛋白質(zhì)資源，但因棉粕含有對動物機體有毒害的游離棉酚，其利用價值和使用量就受到了極大的限制。采用微生物發(fā)酵的方法不僅可以對棉粕進行脫毒，還可以提高棉粕的蛋白質(zhì)含量和營養(yǎng)價值，因而成為目前一項重要的技術。其中，發(fā)酵菌株的篩選和發(fā)酵條件的優(yōu)化是微生物發(fā)酵棉粕脫毒技術中兩個十分重要的方面。為消除棉粕中原位微生物的影響，目前大多在實驗研究中采用將原棉粕進行高壓滅菌的前處理，但高溫前處理往往會大大降低棉粕中棉酚的含量；進而影響對高效菌株的篩選和對實際發(fā)酵效果的判斷；并且在實際生產(chǎn)中，將會大大增加能耗。因此，無論在研究中或者在生產(chǎn)中，都希望原棉粕在進行微生物發(fā)酵前不經(jīng)過高溫處理，但在這種條件下的微生物發(fā)酵棉粕是包括棉粕中原位微生物在內(nèi)的多種微生物共同作用的過程。由于微生物的多樣性以及不可培養(yǎng)微生物的存在，研究棉粕發(fā)酵過程中微生物的作用過程和機制，微生物群落結構多樣性及其演替規(guī)律，常規(guī)的培養(yǎng)方法顯然已不能滿足需要，新方法的介入是該領域研究的必然趨勢。目前受到廣泛應用的分子生態(tài)學技術可以很好的應用到微生物發(fā)酵棉粕的相關研究中，并解決當前面臨的難題。

大多數(shù)用于微生物群落結構和多樣性分析的分子生態(tài)學技術基于16S?rDNA基因序列的多樣性，所有技術關鍵的第一步在于從樣品中提取足量的DNA，然后再進行后續(xù)的分析。對于環(huán)境樣品來說，在DNA提取過程中為減少可能的微生物多樣性的損失，目前多采用原位裂解微生物提取DNA的方法。由于環(huán)境樣品的復雜性，不同的DNA提取方法獲得的DNA質(zhì)量差異很大，因而衍生了諸多的環(huán)境樣品DNA的提取方法。棉粕及其發(fā)酵產(chǎn)物是一種特殊的樣品，含有大量的蛋白類、多糖類和酚類等物質(zhì)，使得對其中的微生物總DNA的提取極其困難，尤其是棉粕中含有的酚類物質(zhì)對提取獲得的DNA的后續(xù)分子操作有著嚴重的影響，然而目前國內(nèi)外尚未有針對該類樣品微生物總DNA提取的研究和方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是，針對棉粕及其發(fā)酵產(chǎn)物中所含有的蛋白類、多糖類和酚類物質(zhì)在對微生物總DNA的提取過程中，以及尤其是酚類物質(zhì)在對提取獲得DNA的后續(xù)分子操作中所產(chǎn)生的不利影響，提出一種能簡單、高質(zhì)量提取棉粕發(fā)酵產(chǎn)物中微生物的總DNA，和該微生物總DNA不經(jīng)純化即可用于后續(xù)分子操作，以用于微生物發(fā)酵棉粕相關研究中的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：

棉粕發(fā)酵樣品微生物總DNA的提取方法，該方法按以下步驟進行：

(1)稱取棉粕發(fā)酵樣品0.5-2g置于滅菌的10mL?eppendoff管中，加入3-5mL^-1棉粕脫色緩沖液，在渦旋混合器上混合2-3min，37-45℃水浴10min，再渦旋混合2-3min，6000-9000×g離心10-15min，用移液槍吸棄去上清液；重復上述步驟2-5次直至上層液體顏色由褐色轉(zhuǎn)為淡黃色；

(2)在步驟(1)的沉淀物中加入1-3mL棉粕發(fā)酵樣品微生物DNA提取緩沖液，再加入溶菌酶使其在提取混合物中的濃度為2-4mg·mL^-1，混勻后37℃水浴1.5-2h；隨后加入十六烷基三甲基溴化胺(SDS)使其在提取混合物中的濃度為1％-2％，混勻后加入蛋白酶K，使其在提取混合物中的濃度為0.2-0.4mg·mL^-1，混勻后55℃水浴1-2h；水浴后在提取混合物中加入5mol·L^-1的NaCl溶液使其在提取混合物中的濃度為0.7-0.9mol·L^-1；

(3)在提取混合物中按體積比加入15％65℃預熱的CTAB-NaCl溶液，混勻后65℃水浴20-30min；在混合物中再加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻后10000-14000×g離心10-15min，將上清液移入新的eppendoff管中；重復上述步驟2-3次，至離心后eppendoff管中液相和有機相之間沒有沉淀物；