[發(fā)明專利]棉粕發(fā)酵樣品微生物總DNA的提取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910099538.1
• 申請日: 2009-06-18
• 公開（公告）號: CN101591651A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王新;湯江武;姚曉紅;吳逸飛
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C07H21/04
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 沈伾伾

1.棉粕發(fā)酵樣品微生物總DNA的提取方法，其特征在于按以下步驟進行：

(1)稱取棉粕發(fā)酵樣品0.5-2g置于滅菌的10mL?eppendoff管中，加入3-5mL^-1棉粕脫色緩沖液，在渦旋混合器上混合2-3min，37-45℃水浴10min，再渦旋混合2-3min，6000-9000×g離心10-15min，用移液槍吸去上清液；重復(fù)上述步驟2-5次直至上層液體顏色由褐色轉(zhuǎn)為淡黃色，獲得沉淀物；其中，所述的棉粕脫色緩沖液用去離子水配制，成份為：50-100mmol·L^-1Tris-Cl，20-50mmol·L^-1EDTA，100-300mmol·L^-1?NaCl，0.01-0.03g·mL^-1聚乙烯吡咯烷酮，0.01-0.03g·mL^-1?Na₂CO₃，此緩沖液的pH調(diào)為9.5-10.5；

(2)在步驟(1)的沉淀物中加入1-3mL棉粕發(fā)酵樣品微生物DNA提取緩沖液，再加入溶菌酶使其在提取混合物中的濃度為2-4mg·mL^-1，混勻后37℃水浴1.5-2h；隨后加入十六烷基三甲基溴化胺使其在提取混合物中的濃度為1％-2％，混勻后加入蛋白酶K，使其在提取混合物中的濃度為0.2-0.4mg·mL^-1，混勻后55℃水浴1-2h；水浴后在提取混合物中加入5mol·L^-1的NaCl溶液使其在提取混合物中的濃度為0.7-0.9mol·L^-1；其中，所述的棉粕發(fā)酵樣品微生物DNA提取緩沖液用去離子水配制，成份為：50-100mmol·L^-1Tris-Cl，20-50mmol·L^-1?EDTA，100-300mmol·L^-1?NaCl，0.01-0.02g·mL^-1聚烯吡咯烷酮，1-3％十六烷基三甲基溴化銨，此緩沖液的pH調(diào)為8.0；

(3)在提取混合物中按體積比加入15％65℃預(yù)熱的CTAB-NaCl溶液，混勻后65℃水浴20-30min；在混合物中再加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻后10000-14000×g離心10-15min，將上清液移入新的eppendoff管中；重復(fù)上述步驟2-3次，至離心后eppendoff管中液相和有機相之間沒有沉淀物；

(4)在裝有上清液的eppendoff管中按體積比加入β-巰基乙醇使其濃度為2％；混勻后加入等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻后10000-14000×g離心10-15min，將上清液移入新的eppendoff管中；在該管中加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，混勻后10000-14000×g離心10-15min，將上清液移入新的eppendoff管中，重復(fù)上述步驟2-3次，使離心后eppendoff管中液相和有機相之間沒有沉淀物；

(5)在步驟(4)上清液中加入0.6-0.8倍體積的4℃預(yù)冷的異丙醇，混勻后在4℃下放置0.5-1h，以10000-14000×g離心15-20min，棄去上清液；用70％的乙醇洗滌沉淀物2-3次后，用無菌風(fēng)吹干，加入50-100μL含有1μg·mL^-1RNase的TE緩沖液溶解DNA，37℃水浴20-30min后移入1.5mLeppendoff管中，-20℃保存。