[發明專利]5-氨基乙酰丙酸脫水酶抑制劑的篩選方法及使用方法

無效

• 申請號: 200910099465.6
• 申請日: 2009-06-08
• 公開（公告）號: CN101586147A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 林建平;傅維琦;岑沛霖
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/527
• 分類號: C12Q1/527;C12P13/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 韓介梅

技術領域

本發明涉及5-氨基乙酰丙酸脫水酶抑制劑的篩選方法及使用方法。

背景技術

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic?acid，ALA)廣泛存在于生物體中，是合成血紅素、葉綠素、維生素B₁₂等四吡咯化合物的共同前體物質。ALA作為一種光動力學劑(photodynamic?agent，PDT)于1999年在美國批準上市。目前ALA在農用化學品和醫學領域具有廣泛的用途。在農業領域，ALA可作為除草劑、殺蟲劑等并具有增加植物抗寒、抗鹽性和促進植物生長等多種功能，作為易降解無殘留、對人畜無毒性的新一代生物農藥，ALA成為極具發展前途的無公害綠色農用化學品。在醫學領域，作為新一代光動力學藥劑其具有毒性小，選擇性高等顯著優點，可在臨床上用于治療胃癌、皮膚癌、膀胱癌、結腸癌和胰腺癌等多種癌癥，在光化療領域正逐步展現其巨大的應用性。基于ALA的功能和廣闊的應用前景，其合成研究已經引起廣泛的重視。

目前ALA的生產多采用化學法合成，其步驟多、副產物毒性大且得率低；而生物誘變法生產ALA，主要是優化類球紅細菌突變株，所報道ALA的最高產量為27mmol/L，但其培養周期長，成本較高。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于生產5-氨基乙酰丙酸的5-氨基乙酰丙酸脫水酶抑制劑的篩選方法及使用方法。

5-氨基乙酰丙酸脫水酶抑制劑的篩選方法，其步驟為：

1)用接種針從保藏編號為CGMCC?No.1939工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA的甘油管中蘸取菌液(大腸桿菌埃希氏菌，在中國專利局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期：2007.1.25，保藏編號為：CGMCC?No.1939)，在含有30-40μg/ml卡那霉素和30-40μg/ml氯霉素的LB培養基平板上劃線后，置于37℃烘箱中過夜培養；

2)將平板上的單克隆接種于含30-50ml?LB培養基的250ml搖瓶中，轉速為200-220rmp，在37℃培養7-10h得到種子；

3)取2ml-4ml種子接種于含100-150ml?LB培養基的500ml的搖瓶中，起始培養溫度為37℃，2h后降至27-29℃，再用0.05-0.2mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導；

4)誘導培養4-8h，在菌體密度OD₆₀₀達到3-5時，收獲菌體；

5)菌體經離心和超聲破胞后獲得粗酶液，親和層析分離粗酶液獲得重組的5-氨基乙酰丙酸合成酶，提取5-氨基乙酰丙酸合成酶后的粗酶液經凝膠過濾層析獲得5-氨基乙酰丙酸脫水酶；

6)將糖類物質添加到5-氨基乙酰丙酸合成酶的水溶液中，并測定酶的活力，與不添加糖類物質的5-氨基乙酰丙酸合成酶的水溶液比較酶的活力，篩選對5-氨基乙酰丙酸合成酶的活力沒有抑制作用的糖類；再將篩選得到的糖類添加到5-氨基乙酰丙酸脫水酶的水溶液中，并測定酶的活力，與不添加糖類的5-氨基乙酰丙酸脫水酶的水溶液比較酶的活力，篩選具有抑制5-氨基乙酰丙酸脫水酶活力作用的糖類，即為5-氨基乙酰丙酸脫水酶的抑制劑。

本發明中，所說的糖類物質為D-葡萄糖，D-木糖，D-果糖，D-甘露糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，乳糖，蔗糖或麥芽糖。

本發明篩選的5-氨基乙酰丙酸脫水酶抑制劑用于生產5-氨基乙酰丙酸的方法：將5-氨基乙酰丙酸脫水酶的抑制劑配制成濃度為300-350g/L木糖水溶液，加到生產5-氨基乙酰丙酸的發酵罐中，使木糖初始濃度為4g/L，首次添加時間為發酵開始后4小時，在以后發酵過程中維持木糖濃度在3-6g/L。

本發明篩選得到的5-氨基乙酰丙酸脫水酶抑制劑屬于生物質資源，對環境友好，有利于資源利用和環境保護，作為抑制劑添加于生產ALA發酵過程中，可使胞外ALA產量明顯提高，具有廣闊的工業化前景。

附圖說明

圖1是糖類物質對于ALA脫水酶的抑制作用。

具體實施方式

以下結合實施例進一步說明本發明

實施例1

5-氨基乙酰丙酸脫水酶抑制劑的篩選方法，其步驟為：