[發(fā)明專(zhuān)利]5-氨基乙酰丙酸脫水酶抑制劑的篩選方法及使用方法無(wú)效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 200910099465.6 | 申請(qǐng)日： | 2009-06-08 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN101586147A | 公開(kāi)（公告）日： | 2009-11-25 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 林建平;傅維琦;岑沛霖 | 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人： | 浙江大學(xué) |
| 主分類(lèi)號(hào)： | C12Q1/527 | 分類(lèi)號(hào)： | C12Q1/527;C12P13/00 |
| 代理公司： | 杭州求是專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 | 代理人： | 韓介梅 |
| 地址： | 310027*** | 國(guó)省代碼： | 浙江;33 |
| 權(quán)利要求書(shū)： | 查看更多 | 說(shuō)明書(shū)： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 氨基 乙酰 丙酸 脫水酶 抑制劑 篩選 方法 使用方法 | ||
1.5-氨基乙酰丙酸脫水酶抑制劑的篩選方法，其步驟為：
1)用接種針從保藏編號(hào)為CGMCC?No.1939工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-R.S.hemA的甘油管中蘸取菌液，在含有30-40μg/ml卡那霉素和30-40μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基平板上劃線后，置于37℃烘箱中過(guò)夜培養(yǎng)；
2)將平板上的單克隆接種于含30-50ml?LB培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，轉(zhuǎn)速為200-220rmp，在37℃培養(yǎng)7-10h得到種子；
3)取2ml-4ml種子接種于含100-150ml?LB培養(yǎng)基的500ml的搖瓶中，起始培養(yǎng)溫度為37℃，2h后降至27-29℃，再用0.05-0.2mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)；
4)誘導(dǎo)培養(yǎng)4-8h，在菌體密度OD600達(dá)到3-5時(shí)，收獲菌體；
5)菌體經(jīng)離心和超聲破胞后獲得粗酶液，親和層析分離粗酶液獲得重組的5-氨基乙酰丙酸合成酶，提取5-氨基乙酰丙酸合成酶后的粗酶液經(jīng)凝膠過(guò)濾層析獲得5-氨基乙酰丙酸脫水酶；
6)將糖類(lèi)物質(zhì)添加到5-氨基乙酰丙酸合成酶的水溶液中，并測(cè)定酶的活力，與不添加糖類(lèi)物質(zhì)的5-氨基乙酰丙酸合成酶的水溶液比較酶的活力，篩選對(duì)5-氨基乙酰丙酸合成酶的活力沒(méi)有抑制作用的糖類(lèi)；再將篩選得到的糖類(lèi)添加到5-氨基乙酰丙酸脫水酶的水溶液中，并測(cè)定酶的活力，與不添加糖類(lèi)的5-氨基乙酰丙酸脫水酶的水溶液比較酶的活力，篩選具有抑制5-氨基乙酰丙酸脫水酶活力作用的糖類(lèi)，即為5-氨基乙酰丙酸脫水酶的抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的5-氨基乙酰丙酸脫水酶抑制劑的篩選方法，其特征在于所說(shuō)的糖類(lèi)物質(zhì)為D-葡萄糖，D-木糖，D-果糖，D-甘露糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，乳糖，蔗糖或麥芽糖。
3.權(quán)利要求1所述的5-氨基乙酰丙酸脫水酶抑制劑用于生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的方法：將5-氨基乙酰丙酸脫水酶的抑制劑配制成濃度為300-350g/L木糖水溶液，加到生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的發(fā)酵罐中，使木糖初始濃度為4g/L，首次添加時(shí)間為發(fā)酵開(kāi)始后4小時(shí)，在以后發(fā)酵過(guò)程中維持木糖濃度在3-6g/L。
該專(zhuān)利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專(zhuān)利權(quán)人授權(quán)。該專(zhuān)利全部權(quán)利屬于浙江大學(xué)，未經(jīng)浙江大學(xué)許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購(gòu)買(mǎi)此專(zhuān)利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請(qǐng)聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/200910099465.6/1.html，轉(zhuǎn)載請(qǐng)聲明來(lái)源鉆瓜專(zhuān)利網(wǎng)。
