[發明專利]胰島素樣分泌細胞的制備法及所用的組合培養基

無效

• 申請號: 200910099429.X
• 申請日: 2009-06-15
• 公開（公告）號: CN101570741A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發明（設計）人: 吳育連;謝秋萍
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司
• 代理人: 金 祺

技術領域

本發明屬于生物和醫藥技術領域，特別是一種利用成人骨髓間充質干細胞(hBM-MSCs)來制備胰島素樣分泌細胞的方法及所用的組合培養基。

背景技術

隨著生活水平的提高，糖尿病已成為威脅全人類健康、生命的重大社會問題，給社會造成巨大的經濟負擔。而胰島移植被認為是目前治療胰島素依賴型糖尿病的最有效手段，然而，由于供體胰腺的嚴重缺乏，限制了胰島移植的廣泛臨床開展。異體移植由于具有嚴重的免疫排斥問題，無法真正用于臨床實施。近年來，干細胞技術的發展及干細胞胰島分化技術的調控，成為解決胰島移植供體緊缺難題的新希望。

小鼠及人的胚胎干細胞已有報道可以被誘導分化為能分泌胰島素的細胞，但胚胎干細胞存在倫理學限制，同時資源有限，且移植后仍存在異體移植免疫排斥。hBM-MSCs具有多向分化潛能，可向內、中、外三胚層細胞分化，且來源取材方便，資源豐富，并可以實現自體移植，是糖尿病β細胞替代治療的理想種子細胞。通過體外、體內移植功能等多方面監測、評價其誘導效率，建立有效的體外誘導調控的方法，促進hBM-MSC分化為具有糾正糖尿病高血糖狀態的胰島素樣分泌細胞，是促進胰島移植發展迫切需要解決的問題。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種胰島素樣分泌細胞的制備法及所用的組合培養基，采用本發明的方法能將hBM-MSCs分化成胰島素樣分泌細胞。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種制備胰島素樣分泌細胞用的組合培養基，由分別獨立的培養基I、培養基II和培養基III組成；

培養基I為：DMEM高糖培養基，1-2％FBS(胎牛血清)，9-11ng/ml?bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)，1％DMSO(二甲基亞砜)，17-25mmol/l葡萄糖；

培養基II為：無血清DMEM/F12培養基，15-19mmol/l葡萄糖，9-11mmol/l尼克酰胺，18-22ng/ml?EGF(表皮生長因子)，18-22ng/ml?bFGF(堿性成纖維細胞生長因子)，10nmol/l?exendin-4，1％B27添加劑和1％N2添加劑；

培養基III為：RPMI?1640培養基，10-12mmol/l葡萄糖，9-11mmol/l尼克酰胺，9-11mmol/l?Hepes(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)，90-110pmol/l?HGF(肝細胞生長因子)，1.5-2.5nmol/l?activin-A(激活素A)，9-11nmol/l?exendin-4。

本發明還同時提供了利用上述組合培養基進行的胰島素樣分泌細胞制備法，采用3-5代hBM-MSCs，包括以下步驟：

1)、以培養基I重懸3-5代hBM-MSCs，然后以2-3×10⁴個細胞/cm²密度接種于6孔板，于37℃、5％CO₂的環境，接種時間為65～80小時；

2)、將上述接種后所得的細胞用PBS(磷酸緩沖液)洗滌，將洗滌后的細胞放入培養基II中于37℃、5％CO₂環境下孵育140～160小時；

3)、去除步驟2)所得物中的培養基II，然后加入培養基III，于37℃、5％CO₂環境孵育110～130小時，得胰島素樣分泌細胞。

可以采用DTZ染色來鑒定分化后細胞胰島樣分泌細胞形成的效率，采用該方法檢測后的細胞仍能用于后續的移植。

在本發明中，

培養基I的制備方法如下：在100ml的DMEM高糖培養基中加入1-2ml的FBS、900-1100ng的bFGF、1ml的DMSO和1.7-2.5mmol葡萄糖混合而成。

培養基II的制備方法如下：在100ml的無血清DMEM/F12培養基中加入1.5-1.9mmol的葡萄糖、0.9-1.1mmol的尼克酰胺、1800-2200ng的EGF、1800-2200ng的bFGF、1nmol的exendin-4、1ml的B27添加劑和1ml的N2添加劑。

培養基III的制備方法如下：在100ml的RPMI?1640培養基中加入1.0-1.2mmol的葡萄糖、0.9-1.1mmol的尼克酰胺、0.9-1.1mmol的Hepes、9-11pmol的HGF、0.15-0.25nmol的activin-A和0.9-1.1nmol的exendin-4。