[發(fā)明專利]用于熒光定量PCR法檢測腸道光滑念珠菌的試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910098557.2
• 申請日: 2009-05-14
• 公開（公告）號: CN101555524A
• 公開（公告）日: 2009-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李蘭娟;陳瑜;郭仁勇;魯海峰;陳珍晶
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/72
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 唐銀益

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體涉及一種用于熒光定量PCR法檢測腸道光滑念珠菌的試劑盒。

背景技術(shù)

在正常人類腸道中存在一個豐富、多樣的真菌群落。人們采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法已經(jīng)對人類腸道真菌進行了許多研究(Khatib?R，Riederer?KM，Ramanathan?J，et?al.Faecalfungal?flora?in?healthy?volunteers?and?inpatients.Mycoses，2001，44：151-6.)，該方法通過對真菌表型進行診斷，觀察固體培養(yǎng)基上的菌落生長和繁殖情況，根據(jù)菌落形狀、大小、顏色、粘性以及其他結(jié)構(gòu)特征鑒定真菌，結(jié)合不同的生理、生化和耐熱性試驗等進行形態(tài)學(xué)診斷。運用分離培養(yǎng)法可以準(zhǔn)確的診斷某些致病性真菌，但是，在某些特殊情況下，比如分離培養(yǎng)的菌落形態(tài)不典型、特殊培養(yǎng)基無法獲取、培養(yǎng)時間過長、表型結(jié)果非特異等等，則無法對真菌病原體進行準(zhǔn)確診斷，需要依靠非培養(yǎng)診斷技術(shù)進行真菌鑒定。

實時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物的各個領(lǐng)域(Espy?MJ，Uhl?JR，et?al.Real-time?PCR?in?clinical?microbiology：applications?for?routine?laboratorytesting.Clin?Microbiol，2006，Rev?19(1)：165-256.)。該技術(shù)不僅能夠從本質(zhì)上增加病原體檢測的靈敏度，結(jié)合種特異性引物和擴增產(chǎn)物融解曲線分析可以特異的檢測和鑒定某種病原體，檢測過程無需分離培養(yǎng)，操作簡便、快速，極大的縮短了診斷時間；并且可以作為病原體感染患者治療療效的監(jiān)測手段。但是，由于人類腸道微生態(tài)群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在大約10¹⁴個不同的微生物有機體，而真菌所占比例較低，不到1％；某些真菌菌種的生長還需要復(fù)雜的培養(yǎng)條件，分離培養(yǎng)法只能檢測到一小部分條件適合的微生物，檢測靈敏度低且診斷周期長。而實時熒光定量PCR技術(shù)是基于對病原體核苷酸的檢測，不受培養(yǎng)條件限制且檢測靈敏度高，有利于更加準(zhǔn)確、全面的了解真菌群落在腸道病理生理過程中的作用。利用實時熒光定量PCR技術(shù)能夠準(zhǔn)確、快速的檢測和鑒定真菌病原體，這對于及時治療和有效控制腸道真菌感染都至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于熒光定量PCR法檢測腸道光滑念珠菌的試劑盒。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

提供一種用于熒光定量PCR法檢測腸道光滑念珠菌的試劑盒，該試劑盒包括：

反應(yīng)總體積1/10的10×Taqman?PCR?buffer；

各0.15μmol/L～1μmol/L的上游和下游引物；

各200μmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；

2.0mmol/L～3.5mmol/L的MgCl₂；

0.05U/μl?HOTSTART?Taq?DNA聚合酶；

0.02×SYBR?green?I熒光染料；

標(biāo)準(zhǔn)陽性模版，其濃度按定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的要求系列稀釋；

余量為無菌雙蒸水；

所述兩條引物為PCR擴增過程中使用的特異性擴增光滑念珠菌ITS區(qū)的引物：

上游引物序列為：5’-CCCACATACTGATATGGCATACAA-3’(SEQ?ID?NO：1)

下游引物序列為：5’-TTATCACACCACTCGACACT-3’(SEQ?ID?NO：2)

所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模版為光滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA經(jīng)前述引物擴增，擴增產(chǎn)物與pGEMT-TEasy載體連接后獲得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA；編碼所述擴增產(chǎn)物的基因具有SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

操作簡便、快速；特異性好，靈敏度高；基于對核苷酸的檢測，不受培養(yǎng)條件限制；定量檢測，能真實反映腸道光滑念珠菌定植和發(fā)生感染的情況；可同時進行高通量的樣本檢測。本發(fā)明提供的試劑盒可對腸道光滑念珠菌進行快速定量檢測，可以替代一直沿用的分離培養(yǎng)的傳統(tǒng)診斷方法，并適于在臨床實驗室廣泛推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1為將本發(fā)明試劑盒標(biāo)準(zhǔn)陽性模版梯度稀釋后，進行熒光定量PCR擴增所得的動力曲線圖，橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表相對熒光強度，圖中平行于橫坐標(biāo)的直線代表熒光閾值。