[發(fā)明專利]檢測志賀氏菌的酶免疫傳感器及其制備方法和運(yùn)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910097577.8
• 申請日: 2009-04-16
• 公開（公告）號: CN101532980A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙廣英;詹學(xué)佳
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工商大學(xué)
• 主分類號: G01N27/333
• 分類號: G01N27/333;G01N33/569;G01N27/48
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 徐關(guān)壽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及食源性致病菌快速檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是基于抗原抗體免疫反 應(yīng)檢測志賀氏菌的酶免疫傳感器及其制備方法和運(yùn)用。

背景技術(shù)

在全世界每年數(shù)以億計的食源性疾病患者中，70％是由于食用了各種致病 性微生物污染的食品和飲水造成的。志賀氏菌(Shigella)是引起急性感染性腹瀉 的主要病原體之一，少至10個細(xì)菌即可引起感染，感染人體會出現(xiàn)惡心、嘔吐、 腹痛、腹瀉(嚴(yán)重膿血便)等癥狀，甚至危及生命。每年有一百多萬人因為感染志 賀氏菌而死亡，死者多為發(fā)展中國家的兒童。

志賀氏菌快速檢測是進(jìn)行大批量健康人群的體檢和處理突發(fā)公共衛(wèi)生事件 的最關(guān)鍵措施之一，對快速實施預(yù)防、治療具有極為重大的意義。

目前，志賀氏菌常用檢測方法包括國標(biāo)法、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、PCR 及RT-PCR技術(shù)，基因芯片和核酸探針技術(shù)。國標(biāo)法取材方便，但樣品預(yù)處理復(fù) 雜、操作過程比較繁瑣，檢測周期較長，敏感度低；ELISA需要特殊的儀器設(shè)備， 檢測步驟繁瑣、費(fèi)用高、檢測時間長，并且易出現(xiàn)假陽性；PCR、基因芯片和核 酸探針技術(shù)所需儀器設(shè)備昂貴、檢測過程復(fù)雜，對檢測環(huán)境和操作人員專業(yè)技 術(shù)要求較高、所使用的試劑對人體和環(huán)境均有較大的危害，也易出現(xiàn)假陽性。 因此，建立一種靈敏、快速、簡便、特異性高且經(jīng)濟(jì)的志賀氏菌檢測方法是食 品生產(chǎn)經(jīng)營企業(yè)、質(zhì)控人員、進(jìn)出口商檢、政府管理部門的迫切需要和食品安 全的有力保障。

電化學(xué)分析可以實現(xiàn)現(xiàn)場檢測，不受樣品顏色、濁度的影響，樣品可以不 經(jīng)處理，無需分離，所用儀器設(shè)備相對簡單，這些都使得電化學(xué)免疫傳感成為 一種使用較為廣泛的檢測方法。近年來，在食源性致病菌檢測領(lǐng)域中，免疫傳 感器越來越引起人們的重視。它將電化學(xué)檢測和傳統(tǒng)免疫技術(shù)相結(jié)合的分析方 法，既有很好的特異性，又有較低的檢測限。而且與其他技術(shù)相比，這種傳感 器對儀器設(shè)備的要求低，操作簡單，更大大地縮短了檢測時間。采用絲網(wǎng)印刷 工藝制備的一次性使用電極更進(jìn)一步降低了檢測成本，在大規(guī)模地快速、準(zhǔn)確 檢測食源性致病菌中發(fā)揮著重要作用。

自從1991年Iijima發(fā)現(xiàn)多壁碳納米管(multi-wall?carbon?nanotube)以來，多 壁碳納米管因其優(yōu)良的電學(xué)、力學(xué)性能以及潛在的應(yīng)用前景而引起廣泛關(guān)注。 多壁碳納米管復(fù)合材料具有良好的導(dǎo)電性能和有利于保持生物分子活性，非常 適合于生物傳感器的制備與應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決以上問題，本發(fā)明提供了一種靈敏、快速、準(zhǔn)確、特異性高且經(jīng) 濟(jì)的檢測志賀氏菌的酶免疫傳感器，包括絲網(wǎng)印刷電極，所述絲網(wǎng)印刷電極的 工作電極上涂布有包埋“酶標(biāo)記志賀氏菌抗體-碳納米管-殼聚糖”混合物的敏感 膜。

優(yōu)選地，所述的碳納米管為多壁碳納米管。

進(jìn)一步地，所述的志賀氏菌為福氏志賀氏菌。

更進(jìn)一步地，所述的酶標(biāo)記志賀氏菌抗體為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、 乳酸脫氧酶、葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、尿素水解酶標(biāo)記的志賀氏菌抗體 中的一種或它們的混合物。

另一方面，本發(fā)明提供了上述酶免疫傳感器的制備方法，其特征是包括以 下步驟：

1)將碳納米管超聲分散在殼聚糖溶膠中，得均一的碳納米管-殼聚糖復(fù)合 物；

2)將酶標(biāo)記志賀氏菌抗體與碳納米管-殼聚糖復(fù)合物充分混合均勻，4℃ 放置12h，制得“酶標(biāo)記志賀氏菌抗體-碳納米管-殼聚糖”混合物；

3)將“酶標(biāo)記志賀氏菌抗體-碳納米管-殼聚糖”混合物涂布在絲網(wǎng)印刷電 極的工作電極表面，室溫下干燥；

4)涂膜后的電極浸泡于含0.2％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖溶液中，4℃ 下放置1h。

本發(fā)明還提供了一種使用上述酶免疫傳感器檢測志賀氏菌的方法，其特征 是包括以下步驟：

1)待測樣本滴于酶免疫傳感器的工作電極表面，28℃孵育30min；

2)免疫傳感器置于電解池中，電解池的檢測底液為含有0.6mmol/L?H₂O₂和1.0mmol/L硫堇的醋酸鹽緩沖液，pH值為7.0；

3)設(shè)定適宜的掃描參數(shù)，對工作電極施加電壓，檢測輔助電極與工作電 極間的電流值；

4)測定獲得的電流信息輸入數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)；

5)信息處理結(jié)果輸出。