[發明專利]大黃魚精子超低溫凍存方法及凍存裝置

無效

• 申請號: 200910096614.3
• 申請日: 2009-03-11
• 公開（公告）號: CN101502256A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發明（設計）人: 竺俊全;葉霆;王春琳
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;F25D3/10
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所（普通合伙）
• 代理人: 程曉明

技術領域

本發明涉及魚類精子超低溫冷凍保存方法，具體涉及大黃魚精子超低溫凍存方法及 凍存裝置。

背景技術

大黃魚是我國名貴的海產經濟魚類，東南沿海重要的養殖種，目前大黃魚自然資源 稀少，養殖大黃魚不同程度地出現種質退化現象，影響其養殖業健康可持續發展。魚類 精子超低溫凍存是種質保存的有效途徑之一，將大魚類的優質精子超低溫冷凍起來，建 立精子庫長期保存，對其種質資源的保護具有重要意義，亦能為品種改良及新品種培育 提供優良種質材料。

目前，魚類精子超低溫凍存主要采用計算機控制的程序降溫儀降溫法及簡易降溫裝 置分步降溫法。程序降溫儀體積較大、操作較復雜，適合在實驗室內使用，不方便攜帶 到野外使用；簡易降溫裝置可根據使用要求自行設計、費用省、體積小而輕，方便攜帶 到野外使用。由于魚類精子的采集地往往在野外，離實驗室較遠，而且魚類精子采集后， 其活力在1～2小時之后會逐漸減弱，因此，將采集的精子通常采用簡易降溫裝置分步降 溫法超低溫冷凍精子。如中國專利公開號為101088511，公開日為2007年12月19日， 名稱為魚類精子超低溫冷凍保存簡易方法發明專利申請就公開了魚類精子經稀釋液稀 釋，冰箱內平衡后，加入抗凍劑二甲基亞砜(DMSO)，然后分裝到麥細管中，將麥細 管放置于在泡沫箱內浮于液氮上面的中空泡沫板上，保持20分鐘時間后，將麥細管置 于液氮中至少5分鐘，再轉入液氮罐長期保存。該方法適于淡水魚類精子的超低溫凍存， 由于海水魚類精子與淡水魚類生理特性上的差異，海水魚類的精子壽命較短，該方法對 大黃魚等的海水魚類精子的冷凍保存適用性較差，如精子存活率較低，精子的保存質量 較差，精子凍存后的激活率相對較低。另外該方法是將盛精液的麥細管放置于泡沫箱內 浮于液氮上面的中空泡沫板上，由于泡沫板被液氮蒸氣籠罩，往上放麥細管時看不太清， 操作不方便，延誤凍存時間，還容易發生麥細管放置不當而直接掉入液氮中的失誤操作， 而且中空泡沫板要放入泡沫箱內，要求泡沫箱體積相對較大，為此我們研究發明了對大 黃魚較好的簡易凍存方法和凍存裝置。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種操作方便，精子存活率較高，精子的保存質 量較好，精子凍存后的激活率相對較高的大黃魚精子超低溫凍存方法。

本發明還提供了用于上述凍存方法的凍存裝置，該凍存裝置具有操作較方便，避免 了開蓋后液氮蒸氣籠罩現象，節約凍存時間，避免了麥細管滾動而掉入液氮現象等優點。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：大黃魚精子超低溫凍存方法，包括 下述步驟：

1)抗凍液配制：按體積比85～90∶10～15將稀釋液與抗凍劑混合均勻，配制成抗 凍液置于4℃溫度條件下保存待用，常用抗凍劑為二甲基亞砜(DMSO)；

2)精子采集：挑選性腺發育成熟的雄性大黃魚，擦干其生殖孔周圍體表，輕壓魚 腹獲得精液，置于培養皿或小燒杯中，放于冰浴上；

3)抗凍液與精液的混合液的配制：按體積比1∶2.5～3.5，將上述步驟2的精液與 上述步驟1的抗凍液混合均勻，得到混合液，在4℃溫度條件下平衡10～15分鐘；

4)混合液分裝：將平衡后的0.35～0.45毫升混合液裝于0.5毫升的麥細管中；

5)混合液凍存：將上述步驟4的麥細管擱置于簡易盛有液氮的凍存裝置的凹槽中， 所述凹槽與所述液氮的液面的距離為2.5～3.5厘米，蓋上凍存裝置的蓋保持2.5～3.5分 鐘，然后開蓋將所述麥細管投入所述液氮中，再蓋上凍存裝置的蓋保持4～6分鐘，開 蓋撈出所述麥細管立即轉入液氮罐中保存。

在上述步驟1中，所述稀釋液與所述抗凍劑的體積比為86.7∶13.3，該稀釋液與抗 凍劑的比例對具有較好保證凍存的大黃魚的精子的質量的效果。

所述稀釋液為按下述配方配制而成：

NaCl：??7.25克????KCl：????????0.38克????CaCl₂：????????0.18克

NaHCO₃：1.00克????MgSO₄·7H₂O：0.23克????NaH₂PO₄·2H₂O：0.41克