[發明專利]快速診斷人粒細胞無形體病的免疫層析試紙及其制備法

無效

• 申請號: 200910096459.5
• 申請日: 2009-03-09
• 公開（公告）號: CN101498729A
• 公開（公告）日: 2009-08-05
• 發明（設計）人: 張耀洲;鄭青亮;舒建洪
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543;G01N33/569
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司
• 代理人: 金 祺

技術領域

本發明屬于快速診斷的免疫層析試紙領域，特別是涉及一種含有金標記的msp2抗體檢測人粒細胞無形體病的免疫層析試紙及其制備方法。

背景技術

人粒細胞無形體病(Human?granulocytic?anaplasmosis，HGA)是由嗜吞噬細胞無形體(Anaplasma?phagocytophilum)侵染人末梢血中性粒細胞引起，以發熱伴白細胞、血小板減少和多臟器功能損害為主要臨床表現的蜱傳疾病。自1994年美國報告首例人粒細胞無形體病病例以來，近年來美國每年報告的病例約600-800人。2006年，我國在安徽省發現人粒細胞無形體病病例，其他部分省份也有疑似病例發生。目前，已報道有人粒細胞無形體病的國家有美國、斯洛文尼亞、法國、英國、德國、澳大利亞、意大利及韓國等，但僅美國和斯洛文尼亞分離到病原體。根據國外研究，該病與萊姆病的地區分布相似，我國萊姆病流行區亦應關注此病。該病臨床癥狀與某些病毒性疾病相似，容易發生誤診，嚴重者可導致死亡。

嗜吞噬細胞無形體呈球狀多型性，革蘭氏染色陰性，主要寄生在粒細胞的胞質空泡內，以膜包裹的包涵體形式繁殖。用Giemsa法染色，嗜吞噬細胞無形體包涵體在胞質內染成紫色，呈桑葚狀(圖1)。嗜吞噬細胞無形體為專性細胞內寄生菌，缺乏經典糖代謝途徑，依賴宿主酶系統進行代謝及生長繁殖，主要侵染人中性粒細胞。嗜吞噬細胞無形體的體外分離培養使用人粒細胞白血病細胞系(HL-60)，主要存在于HL-60細胞內與膜結構相連的空泡內，生長繁殖迅速。其感染的空泡內無查菲埃立克體感染所形成的纖維樣結構。嗜吞噬細胞無形體早期的形態多為圓形、密度較大的網狀體，后期菌體變小且密度增大。嗜吞噬細胞無形體的外膜比查菲埃立克體外膜有更多的皺折(圖2)。

動物宿主持續感染是病原體維持自然循環的基本條件。國外報道，嗜吞噬細胞無形體的儲存宿主包括白足鼠等野鼠類以及其他動物。在歐洲，紅鹿、牛、山羊均可持續感染嗜吞噬細胞無形體。該病全年均有發病，發病高峰為5-10月。嗜吞噬細胞無形體的傳播媒介主要是硬蜱屬的某些種(如肩突硬蜱、篦子硬蜱等)。我國曾在黑龍江、內蒙古及新疆等地的全溝硬蜱中檢測到嗜吞噬細胞無形體核酸。人粒細胞無形體病主要通過蜱叮咬傳播。蜱叮咬攜帶病原體的宿主動物后，再叮咬人時，病原體可隨之進入人體引起發病。直接接觸危重病人或帶菌動物的血液等體液，有可能會導致傳播，但具體傳播機制尚需進一步研究證實。國外曾有屠宰場工人因接觸鹿血經傷口感染該病的報道。

人粒細胞無形體病的病理改變包括多臟器周圍血管淋巴組織炎癥浸潤、壞死性肝炎、脾及淋巴結單核吞噬系統增生等，主要與免疫損傷有關。嗜吞噬細胞無形體感染中性粒細胞后，可影響宿主細胞基因轉錄、細胞凋亡，細胞因子產生紊亂、吞噬功能缺陷，進而造成免疫病理損傷。該病潛伏期一般為7-14天(平均9天)。急性起病，主要癥狀為發熱(多為持續性高熱，可高達40℃以上)、全身不適、乏力、頭痛、肌肉酸痛，以及惡心、嘔吐、厭食、腹瀉等。部分患者伴有咳嗽、咽痛。少數病人可有淺表淋巴結腫大及皮疹。可伴有心、肝、腎等多臟器功能損害，并出現相應的臨床表現。重癥患者可有間質性肺炎、肺水腫、急性呼吸窘迫綜合癥以及繼發細菌、病毒及真菌等感染。少數病人可因嚴重的血小板減少及凝血功能異常，出現皮膚、肺、消化道等出血表現，如不及時救治，可因呼吸衰竭、急性腎衰等多臟器功能衰竭以及彌漫性血管內凝血死亡。老年患者、免疫缺陷患者及進行激素治療者感染本病后病情多較危重。

目前實驗室檢測主要有以下幾種方法：(一)包涵體的檢測。(二)血清學檢測。常用血清學方法為間接免疫熒光(IFA)法。(三)嗜粒細胞無形體核酸PCR檢測。目前，國際推薦使用16S?rRNA基因檢測方法，16S?rRNA高度保守，是PCR檢測最常用的擴增靶基因，與熱休克蛋白groEL基因的應用相比，16S?rRNA基因的應用更為廣泛，但groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性。因此，對于診斷及菌株的鑒定，groEL基因均具有重要意義。(四)病原體分離培養。多用HL-60進行嗜吞噬細胞無形體的分離培養。