[發明專利]烏賊胚胎發育及核行為觀察的熒光染色方法

無效

• 申請號: 200910096303.7
• 申請日: 2009-02-19
• 公開（公告）號: CN101493414A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 吳常文;遲長鳳;徐佳晶
• 申請（專利權）人: 浙江海洋學院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 寧波奧凱專利事務所
• 代理人: 白洪長

技術領域

本發明涉及一種水產動物發育及核行為觀察的熒光染色方法，特別涉及烏賊胚胎發育及核行為觀察的熒光染色方法。

背景技術

烏賊，俗稱墨魚，屬頭足綱，十腕目。烏賊肉含有多種氨基酸，營養豐富，肉味鮮美。烏賊墨有凝血作用，主要用于止血，治療血性疾病；還可保護造血干細胞，含有抗癌物質，具有抗腫瘤活性；烏賊骨稱海螵蛸，具有收斂、制酸、止血等功效，曾是我國的四大漁業對象之一，對溫度的適應性較強，在我國沿海分布很廣，是一種經濟價值很高的傳統漁業種類。由于過度捕撈和生態惡化，自20世紀70年代以來，先后出現了衰退現象。有關烏賊胚胎發育及核行為的基礎研究，國內外報道都很少。對烏賊的胚胎發育及核行為觀察，旨在為烏賊基礎生物學研究積累資料，為烏賊的苗種生產及后續的增養殖提供理論依據。研究人員在觀察了烏賊幼體的胚胎時，由于在鏡檢時過程中烏賊墨顏色為黑色，會嚴重影響肉眼的鏡檢的準確性，所以需要一種新的方法來解決這一問題，另外普通肉眼鏡檢方法必需剝去受精卵的卵膜，而破壞受精卵表面存在的物質及結構，甚至導致整個卵變形，嚴重影響觀察結果的客觀性。

發明內容

本發明的目的是提供烏賊胚胎發育及核行為觀察的熒光染色方法，以此解決烏賊墨影響鏡檢效果、普通鏡檢完全卵膜而破壞受精卵表面存在的物質及結構的技術問題，并且該操作方法步驟簡單，操作方便，可以迅速、清晰且直觀的在熒光顯微鏡下觀察到烏賊卵的胚胎發育與核行為。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：烏賊胚胎發育及核行為觀察的熒光染色方法，其具有如下步驟：

①選取烏賊卵，剝離外層卵膜并且只保留最內一層卵膜；

②將步驟①處理后的烏賊卵浸沒在固定液中4℃保存，并且保存期間更換固定液2次至4次；

③將經步驟②固定的烏賊卵用緩沖液沖洗2次至3次后，再用熒光染色劑進行染色，并且染色過程在黑暗環境下進行；

④將經步驟③處理后的烏賊卵的動物極小頭切下，平鋪在載玻片上，并在熒光顯微鏡下拍照成像。

為優化上述技術方案，采取的技術措施還包括：

步驟②中固定液按重量分數含有戊二醛2份至4份、多聚甲醛2.5份至5份、過濾海水90份至96份。

步驟③中的染色劑為4，6-二脒基苯基吲哚，染色時間為30min至50min。

步驟③中的染色劑為Hoechst33258熒光染料，染色時間為5min至8min。

緩沖液為pH7.4的磷酸緩沖液。

步驟④中，熒光顯微鏡的觀察波長為360nm至370nm。

步驟①烏賊卵的長徑為7.5mm至15.0mm、短徑為6.5mm至9.0mm；烏賊卵的內的卵黃長徑為3.0mm至3.6mm、短徑為2.3mm至2.9mm。

過濾海水中含有磷酸緩沖液，并且磷酸緩沖液在過濾海水中的濃度為0.1mol/L。

過濾海水中含有1g/m³至100g/m³的EDTA鈉鹽。

與現有技術相比，本發明的優點在于：

1.將受精卵進行固定，可以在很長的時間內進行觀察，不受胚胎發育時間的限制，且卵形保存完整，避免活體卵質地較軟操作不便的影響。

2.此方法可以解決卵為非透明的烏賊的胚胎觀察時所遇到的必須剝去卵膜造成受精卵表面存在的物質及結構遭到破壞問題。

3.熒光染色后在觀察前用鋒利薄刀片將卵的動物極小頭切下，平鋪在載玻片上，利于觀察，由于選取的避免了卵個體適中，可以有效避免橢球形無法在玻片上觀察到動物極發育的過程的缺陷。

4.本發明方法的步驟簡單，操作方便，可以迅速、清晰且直觀的在熒光顯微鏡下觀察到烏賊卵的胚胎發育與核行為。

附圖說明

圖1是本發明實施例的烏賊胚胎核行為觀察效果圖。

具體實施方式

以下結合附實施例對本發明作進一步詳細描述。

實施例1：烏賊胚胎發育及核行為觀察的熒光染色方法，其具有如下步驟：

①選取烏賊卵，剝離外層卵膜并且只保留最內一層卵膜；

②將步驟①處理后的烏賊卵浸沒在固定液中4℃保存，并且保存期間更換固定液3次；

③將經步驟②固定的烏賊卵用緩沖液沖洗3次后，再用熒光染色劑進行染色，并且染色過程在黑暗環境下進行；

④將經步驟③處理后的烏賊卵的動物極小頭切下，平鋪在載玻片上，并在熒光顯微鏡下拍照成像。

步驟②中固定液按重量分數含有戊二醛2份、多聚甲醛2.5份、過濾海水95.5份。