[發明專利]甘蔗桿狀病毒檢測方法

無效

• 申請號: 200910094881.7
• 申請日: 2009-08-26
• 公開（公告）號: CN101906481A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 李文鳳;黃應昆;王曉燕;尹興祥;盧文潔;羅志明
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院甘蔗研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司 53100
• 代理人: 陳左

技術領域：

本發明植物保護領域，具體是一種甘蔗桿狀病毒檢測方法。

背景技術：

甘蔗桿狀病毒(Sugarcane?Bacilliform?virus，SCBV)是近年來新發生的一種傳播很快的病毒病害，主要通過糖粉蚧(Saccharicoccus?sacchari)和無性繁殖材料類種質傳播。由于甘蔗種苗及育種材料在世界范圍內廣泛交流，現SCBV已擴散到世界上多個甘蔗種植區如古巴、如澳大利亞、馬達加斯、馬拉斯、毛里求斯、南美洲、美國、馬德里、摩洛哥、留尼汪、巴布亞新、幾內亞等國，以及我國的臺灣、廣東、廣西；雖然到目前為止，該病毒對甘蔗生產影響的研究報道還不多見，但建立該病毒的快速檢測方法是阻擊此危險性病毒擴散的重要措施。

指示植物法、電鏡技術或酶聯免疫技術是常用的檢測病毒的方法。由于SCBV癥狀表現不穩定，病株在一定條件下可隱癥，且難于通過機械摩擦傳毒，故利用指示植物癥狀進行檢測難度大；免疫電鏡技術能直觀的觀察到病毒粒子，診斷比較可靠，但儀器昂貴、檢測速度慢、程序繁瑣；酶聯免疫法雖然具有較高的額靈敏度，但制備高純度的抗體復雜繁瑣。

發明內容：

本發明的目的是提供一種快速、靈敏、特異檢測的甘蔗桿狀病毒檢測方法，以克服現有檢測技術中存在的不足。

本發明的這種甘蔗桿狀病毒檢測方法包括以下步驟：

1、引物設計：

根據GenBank數據庫中已報道的甘蔗桿狀病毒基因組序列的保守序列(序列登錄號AJ277091和M89923)設計了擴增甘蔗桿狀病毒的特異性引物PC1/PC2，擴增的目的片段大小為589bp，引物序列如下：

PC1?5′-ACCAGATCCGAGATTACAGAAG-3′

PC2?5′-TCACCTTGCCAACCTTCATA-3′

2、甘蔗葉組織總DNA抽提：

(1)稱取0.5g甘蔗葉片放入研缽中，加適量液氮研磨至粉狀后轉至2ml離心管中；

(2)在裝有研磨物的離心管中加入800ul?65℃預熱的CTAB抽提液，倒置混勻后放入65℃恒溫浴鍋中溫育2hr，中間每隔20min顛倒離心管數次；

(3)取出裝有研磨物和CTAB抽提液的離心管置-20℃冷卻2min；

(4)加入600ul氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻后室溫靜置30s，12000rpm/min離心6min；

(5)取上清液500ul加入2/3體積(340ul)的異丙醇，輕輕混勻；-20℃沉淀2hr；

(6)室溫下8000rpm/min離心6min；

(7)棄上清，沉淀用70％乙醇洗滌2次，室溫風干

(8)沉淀用100ul滅菌去離子水溶解，-20℃保存備用。

3、PCR擴增：

在PCR管里加進2×PCR?Taq?mix?10ul，PC1(20umol/L)0.2ul，PC2(20umol/L)0.2ul，DNA模板2.0ul，ddH₂O?7.6ul，加完后短速離心8～10秒后放進PCR儀，94℃預變性2min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環后72℃延伸5min，4℃保存。

4、電泳檢測：

取10ul?PCR產物點進1.0％瓊脂糖凝膠膠孔里(凝膠里預先加入0.5％的0.5ug/ml溴化乙錠)，在0.5×TBE和140V的電壓下電泳20min后，用BIO-RAD凝膠成像系統觀察，在感染甘蔗桿狀病毒的蔗株中擴增到589bp的條帶，未感染的蔗株則未擴增出條帶。

該發明的有益效果是根據甘蔗桿狀病毒基因組序列設計的特異性引物PC1/PC2，提取甘蔗葉組織的總DNA，采用PCR擴增的方法，檢測甘蔗桿狀病毒，克服了現有檢測技術中的缺點，提供了一種快速、靈敏、特異檢測甘蔗桿狀病毒SCBV的方法。

具體實施方式

1、引物設計：

根據GenBank數據庫中已報道的甘蔗桿狀病毒基因組序列的保守序列(序列登錄號AJ277091和M89923)設計了擴增甘蔗桿狀病毒的特異性引物PC1/PC2，擴增目的片段為大小為589bp，引物序列如下：

PC1?5′-ACCAGATCCGAGATTACAGAAG-3′

PC2?5′-TCACCTTGCCAACCTTCATA-3′

2、甘蔗葉組織總DNA抽提：

(1)稱取0.5g甘蔗葉片放入研缽中，加適量液氮研磨至粉狀后轉至2ml離心管中；