[發(fā)明專利]甘蔗桿狀病毒檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910094881.7
• 申請日: 2009-08-26
• 公開（公告）號(hào): CN101906481A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李文鳳;黃應(yīng)昆;王曉燕;尹興祥;盧文潔;羅志明
• 申請（專利權(quán)）人: 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責(zé)任公司 53100
• 代理人: 陳左

1.一種甘蔗桿狀病毒檢測方法，其特在于包括以下步驟：

(1)引物設(shè)計(jì)：

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的甘蔗桿狀病毒基因組序列的保守序列(序列登錄號(hào)AJ277091和M89923)設(shè)計(jì)了擴(kuò)增甘蔗桿狀病毒的特異性引物PC1/PC2，擴(kuò)增的目的片段大小為589bp，引物序列如下：

PC1?5′-ACCAGATCCGAGATTACAGAAG-3′

PC2?5′-TCACCTTGCCAACCTTCATA-3′

(2)甘蔗葉組織總DNA抽提：

①取0.5g甘蔗葉片放入研缽中，加適量液氮研磨至粉狀后轉(zhuǎn)至2ml離心管中；

②在裝有研磨物的離心管中加入800ul?65℃預(yù)熱的CTAB抽提液，倒置混勻后放入65℃恒溫浴鍋中溫育2hr，中間每隔20min顛倒離心管數(shù)次；

③取出裝有研磨物和CTAB抽提液的離心管置-20℃冷卻2min；

④加入600ul氯仿∶異戊醇＝24∶1混合液，充分混勻后室溫靜置30s，12000rpm/min離心6min；

⑤取上清液500ul加入2/3體積的異丙醇，輕輕混勻；-20℃沉淀2hr；

⑥室溫下8000rpm/min離心6min；

⑦棄上清，沉淀用70％乙醇洗滌2次，室溫風(fēng)干；

⑧沉淀用100ul滅菌去離子水溶解，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(3)PCR擴(kuò)增

在PCR管中按序加入以下試劑：

ddH₂O????????????????????7.6ul

2×PCRTaq?mix????????????10ul

PC1(20umol/L)????????????0.2ul

PC2(20umol/L)????????????0.2ul

DNA模板??????????????????2.0ul

加完后短速離心8～10秒后放進(jìn)PCR儀，94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min，4℃保存；

(4)電泳檢測：

取10ul?PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠，凝膠里預(yù)先加入0.5％的0.5ug/ml溴化乙錠，在0.5×TBE和140V的電壓下電泳20min后，用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察；在感染甘蔗桿狀病毒的蔗株中擴(kuò)增到589bp的條帶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗桿狀病毒檢測方法，其特征在于CTAB抽提液為：100mmol/L?TrisHCl?pH8.0；20mmol/L?EDTA?pH8.0；1.4mol/L?NaCl；2％CTABpH8.0。