[發(fā)明專利]一種改進的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910094875.1
• 申請日: 2009-08-26
• 公開（公告）號: CN101633956A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發(fā)明（設計）人: 李文鳳;黃應昆;王曉燕;盧文潔;羅志明
• 申請（專利權）人: 云南省農業(yè)科學院甘蔗研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司
• 代理人: 陳 左

技術領域：

本發(fā)明涉及植物保護領域，尤其是一種改進的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法。

背景技術：

甘蔗宿根矮化病(ratoon?stuning?disease，RSD)是普遍存在于所有植蔗地區(qū)的一種世界性的重要病害。此病由一種棒桿菌屬細菌(Clavibacter?xyli?subsp.xyli)寄生于蔗株的維管束中引起，主要通過甘蔗種苗傳播蔓延，且傳播性極強。蔗株染病后變矮，蔗莖變細，生長遲滯，宿根發(fā)株少，病害造成損失的程度隨宿根年數(shù)的增加而增加，一般減產10～30％，干旱缺水時可達60％以上，還可導致品種退化。由于甘蔗(RSD)無明顯的外部和內部癥狀，傳統(tǒng)診斷方法極其困難，導致病害任意傳播、擴展蔓延，對甘蔗生產危害極大。防止該病害的發(fā)生和蔓延，最經濟有效的措施就是種植脫毒種苗，隨著甘蔗健康種苗在甘蔗生產上的運用，迫切需要建立起一種能快速、穩(wěn)定、準確、高靈敏度、特異性強檢測RSD的方法。

目前我國對甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法主要有電鏡負染檢測法(EM)、血清檢測法(包括間接酶聯(lián)免疫吸附法及組織斑點免疫檢測法)和PCR檢測法。但電鏡負染檢測需要昂貴的儀器，不適合田間大批量樣品的檢測；血清檢測法靈敏度高，但RSD難于人工分離、純化、培養(yǎng)，所以制備高純度抗體成為此項技術應用的瓶頸；而目前應用于RSD的PCR檢測技術主要是用常規(guī)的CTAB法抽提DNA或病菌快速裂解法釋放DNA后再PCR擴增，雖然快速、但由于抽提或裂解釋放的總DNA含量低，所以檢測靈敏度低、實驗體系不易穩(wěn)定。

發(fā)明內容：

本發(fā)明的目的是提供一種快速、穩(wěn)定、準確、高靈敏度、特異性強的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，以克服現(xiàn)有檢測技術中的缺點。

本發(fā)明包括以下步驟：

1、引物設計：

根據(jù)已報道的RSD病原細菌Lxx?16S-23SrDNA基因間隔區(qū)核苷酸序列設計了一對特異引物Lxx1/Lxx2，擴增的目的片段大小為438bp，引物序列如下：

Lxx1：5′CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′，

Lxx2：5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3；

2、樣品蔗汁采集：

每個樣本隨機取6條蔗莖，每條蔗莖截取中下部莖節(jié)，用砍刀切成7cm左右長，再用鉗子擠壓25ml左右的甘蔗汁于50ml離心管內混勻，放于-20℃冰箱保存待用。

3、蔗汁總DNA提?。?/p>

(1)蔗汁DNA提取前，每樣品取2000ul蔗汁放入離心管中，12000rpm超速離心機上離心10min，棄上清，沉淀加入300ul滅菌去離子水稀釋混勻；

(2)蔗汁DNA提取時，加入600ul經65″C預熱的2％CTAB抽提緩沖液，65℃水浴1hr，期間每隔20min搖勻一次；

(3)加入600ul氯仿/異戊醇(24∶1)劇烈振蕩30s，12000rpm超速離心機上離心10min；

(4)取上清液700ul置于新的1.5ml離心管中，加入等體積氯仿∶異戊醇＝24∶1，溫和地混勻，12000rpm超速離心機上離心10min；

(5)取上清液650ul置于新的1.5ml離心管中，加入2/3體積(455ul)的異丙醇，混勻后置于-20℃冰箱中沉淀4小時；

(6)4℃下12000rpm超速離心機上離心10min，棄上清；

(7)沉淀分別用400ul冷70％乙醇和冷無水乙醇各洗一次，室溫下風干；

(8)沉淀用30ul滅菌去離子水稀釋溶解-20″C保存?zhèn)溆谩?/p>

4、PCR擴增

在PCR管中按序加入以下試劑：

ddH₂O??????????8.6ul

2×PCR?Taq?mix?????8ul

Lxx1(20umol/L)?????0.2ul

Lxx2(20umol/L)?????0.2ul

DNA模板????????????3.0ul

加完后短速離心10秒后放進PCR儀，95℃預變性5mi，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)后72℃延伸5min，4℃保存；

5、電泳檢測：

取10ul?PCR產物經1.5％瓊脂糖凝膠，膠里預先加入0.5％的0.5ug/ml溴化乙錠，在0.5×TBE和140V的電壓下電泳20min后，用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察；在感染甘蔗宿根矮化病的甘蔗樣品中擴增到438bp的條帶。