[發(fā)明專利]一種改進的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910094875.1
• 申請日: 2009-08-26
• 公開（公告）號: CN101633956A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發(fā)明（設計）人: 李文鳳;黃應昆;王曉燕;盧文潔;羅志明
• 申請（專利權）人: 云南省農業(yè)科學院甘蔗研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/01
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司
• 代理人: 陳 左

1、一種改進的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

1)引物設計：

根據(jù)已報道的RSD病原細菌Lxx?16S-23SrDNA基因間隔區(qū)核苷酸序列設計了一對特異引物Lxx1/Lxx2，擴增的目的片段大小為438bp，引物序列如下

Lxx1：5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′，

Lxx2：5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3；

2)樣品蔗汁采集：

每個樣本隨機取6條蔗莖，每條蔗莖截取中下部莖節(jié)，用砍刀切成7cm左右長，再用鉗子擠壓25ml左右的甘蔗汁于50ml離心管內混勻，放于-20℃冰箱保存待用，每取一個樣品后砍刀和鉗子均要用清水沖洗后再用70％的酒精消毒；

3)蔗汁總DNA提取：

(1)蔗汁DNA提取前，每一樣品取2000ul蔗汁放入離心管中，12000rpm超速離心機上離心10min，棄上清，沉淀加入300ul滅菌去離子水稀釋；

(2)蔗汁DNA提取時，加入600ul經65″C預熱的2％CTAB抽提緩沖液，65℃水浴1hr，期間每隔20min搖勻一次；

(3)加入600ul氯仿/異戊醇(24∶1)劇烈振蕩30S，12000rpm超速離心機上離心10min；

(4)取上清液700ul置于新的1.5ml離心管中，加入等體積氯仿∶異戊醇＝24∶1，混勻，12000rpm超速離心機上離心10min；

(5)取上清液650ul置于新的1.5ml離心管中，加入455ul的異丙醇，混勻后置于-20℃冰箱中沉淀4小時；

(6)4℃下12000rpm超速離心機上離心10min，棄上清；

(7)沉淀分別用400ul冷70％乙醇和冷無水乙醇各洗一次，室溫下風干；

(8)沉淀用30ul滅菌去離子水稀釋溶解-20″C保存?zhèn)溆茫?/p>

4)PCR擴增

在PCR管中按序加入以下試劑：

ddH₂O?????????????????????8.6ul

2×PCR?Taq?mix????????????8ul

Lxx1(20umol/L)????????????0.2ul

Lxx2(20umol/L)????????????0.2ul

DNA模板????????????????3.0ul

加完后短速離心10秒后放進PCR儀，95℃預變性5mi，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)后72℃延伸5min，4℃保存；

5)電泳檢測：

取10ul?PCR產物經1.5％瓊脂糖凝膠檢測，膠里預先加入0.5％的0.5ug/ml溴化乙錠，在0.5×TBE和140V的電壓下電泳20min后，用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察；在感染甘蔗宿根矮化病的甘蔗樣品中擴增到438bp的條帶。

2、根據(jù)權利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，其特征在于DNA提取前，取樣品蔗汁2000ul?12000rpm離心10min棄上清后，沉淀加300ul滅菌去離子水稀釋。

3、根據(jù)權利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，其特征在于蔗汁DNA提取時加入2％CTAB抽提緩沖液后，65℃水浴1hr。

4、根據(jù)權利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，其特征在于蔗汁DNA提取時加入異丙醇混勻后-20℃冰箱中沉淀4hr。

5、根據(jù)權利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，其特征在于PCR擴增中的退火溫度為56℃。

6、根據(jù)權利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，其特征在于PCR擴增中循環(huán)數(shù)為35次。

7、根據(jù)權利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，其特征在于電泳檢測時瓊脂糖凝膠濃度為1.5％。