[發(fā)明專利]春蘭雜交種子與細(xì)菌共生萌發(fā)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910094814.5
• 申請(qǐng)日: 2009-08-07
• 公開（公告）號(hào): CN101622922A
• 公開（公告）日: 2010-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龐惠仙
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明市林業(yè)科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): A01C1/00
• 分類號(hào): A01C1/00;A01C1/08;A01N63/00;C12N1/20
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 陳 左

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物栽培技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種春蘭雜交種子與細(xì)菌的萌發(fā)方法。

背景技術(shù)

雜交育種是培育國蘭新品種的重要手段和途徑。但是國蘭種子十分細(xì)小，發(fā)育不健全，缺乏給幼苗提供營養(yǎng)物質(zhì)的胚乳，只有幾百個(gè)尚未分化的胚細(xì)胞組成的種胚，且種皮厚，難吸水。自然狀態(tài)下，國蘭種子只有與菌根真菌共生，才能發(fā)芽長成幼苗。國內(nèi)外關(guān)于菌根真菌與蘭科植物相互關(guān)系的研究已有近百年的歷史，分離出不少對(duì)蘭花種子萌發(fā)和生長有促進(jìn)作用的菌根真菌并生產(chǎn)出相應(yīng)的菌根制劑，如“蘭菌王”等。但菌根真菌對(duì)蘭花種子的萌發(fā)存在不少問題，主要是：真菌的侵染與種子萌發(fā)有某種程度的相對(duì)專一性和選擇性，即某種真菌只對(duì)一種或幾種蘭花種子的萌發(fā)有促進(jìn)作用。除非找到一種或多種蘭菌對(duì)多數(shù)蘭花的種子都有促進(jìn)萌發(fā)的作用，大規(guī)模的推廣才有可能。因此目前共生萌發(fā)技術(shù)對(duì)國蘭種子萌發(fā)而言具有很大的局限性，必須分離出眾多蘭菌與某種國蘭種子作共生萌發(fā)試驗(yàn)，選出共生真菌，而這種真菌未必對(duì)其他國蘭種子萌發(fā)有促進(jìn)作用，真菌分離過程復(fù)雜，操作難度大，效果不理想，技術(shù)尚不成熟。

應(yīng)用無菌萌發(fā)技術(shù)進(jìn)行國蘭及其雜交種子萌發(fā)，已取得突破，但同時(shí)仍存在一些問題。主要是現(xiàn)有技術(shù)還不能使大多數(shù)國蘭及其雜交種子順利萌發(fā)，并且存在萌發(fā)所需時(shí)間長，萌發(fā)率低，萌發(fā)不整齊，持續(xù)時(shí)間太長的問題。縮短國蘭種子的萌發(fā)時(shí)間和提高萌發(fā)率，是縮短國蘭雜交育種周期的關(guān)鍵，也是國蘭雜交育種的關(guān)鍵技術(shù)之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺憾而提出一種春蘭雜交種子與細(xì)菌共生萌發(fā)方法，它在春蘭雜交種子萌發(fā)時(shí)，感染一種芽孢桿菌Bacillus?sp，縮寫為Bs細(xì)菌，為蘭科植物中采用無菌萌發(fā)技術(shù)也難萌發(fā)或萌發(fā)效果不理想的地生蘭類種子提供了一種具有普遍性、簡便、快捷、有效的種子與Bs細(xì)菌共生萌發(fā)方法。

本發(fā)明提出的春蘭雜交種子與Bs細(xì)菌共生萌發(fā)方法的具體步驟如下：

a.將人工授粉，果實(shí)生長七至九成熟的朔果從母株剪下，清理干凈枯殘花瓣，蘸洗衣粉水仔細(xì)刷洗，自來水下沖洗干凈；超凈工作臺(tái)上用酒精棉球擦拭消毒，再浸入0.1％升汞液中消毒15～20分鐘，無菌水洗兩遍，無菌濾紙或紗布擦干蒴果表面水分。

b.在超凈工作臺(tái)無菌器皿上切掉蒴果兩頭，沿蒴果脊線切開果殼，掰開取出種子，將種子均勻播種到事先準(zhǔn)備好的1/2MS+蔗糖20g/L+AC?1g/L+瓊脂粉8g/L，pH值5.6的固體培養(yǎng)基中，播種量根據(jù)種子量和需要而定。無菌萌發(fā)的應(yīng)滴入適量無菌水，以潤濕種子。

c.接種Bs細(xì)菌用1/2MS+土豆(50g/L)提取液+蔗糖20g/L，pH值5.6的液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，常溫保存90天仍有效。共生萌發(fā)接種分三種情況進(jìn)行：

c-1：在播種完種子后隨即接種細(xì)菌，即用吸管吸取細(xì)菌液，分別滴入各培養(yǎng)瓶中，接種量10滴左右。播種后隨即接種細(xì)菌，可縮短種子萌發(fā)時(shí)間，種子萌發(fā)較早，萌發(fā)率高，萌發(fā)整齊。不同雜交組合，其雜交種子發(fā)育情況、種子質(zhì)量不一樣，其種子萌發(fā)所需時(shí)間、萌發(fā)率、萌發(fā)整齊度不同。一般而言，只要種子具有生活力，接種4個(gè)月至13個(gè)月，種子即開始萌發(fā)，持續(xù)萌發(fā)時(shí)間4～10個(gè)月。

c-2：無菌播種效果不好，即一年以上無種子萌發(fā)，或種子萌發(fā)少，萌發(fā)不整齊，此時(shí)接種細(xì)菌，即用吸管吸取細(xì)菌液，分別滴入各培養(yǎng)瓶中，接種量10滴左右，只要種子沒有喪失生活力，接種4個(gè)月至13個(gè)月，種子即開始大量萌發(fā)，持續(xù)萌發(fā)時(shí)間4～10個(gè)月。

c-3：播種時(shí)同時(shí)采用無菌萌發(fā)和細(xì)菌共生萌發(fā)，即：部分種子做無菌萌發(fā)，部分種子做共生萌發(fā)，方法同c-1、c-2。同時(shí)采用兩種萌發(fā)方法，對(duì)于容易萌發(fā)的雜交種子，可同時(shí)得到無菌中間繁殖體，便于進(jìn)行無菌培養(yǎng)，而對(duì)于難萌發(fā)，或萌發(fā)效果不好的雜交種子，也可保證以最短時(shí)間獲得理想的萌發(fā)效果。

整個(gè)接種過程都在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。

d.處理接種完畢的培養(yǎng)瓶，置于溫度23℃±3培養(yǎng)室的培養(yǎng)架上，不補(bǔ)充光照，在室內(nèi)散射光下進(jìn)行萌發(fā)，隨時(shí)觀察種子萌發(fā)情況。如果培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，及時(shí)添加無菌水。

e.與Bs細(xì)菌共生萌發(fā)后發(fā)育成的中間繁殖體即根莖狀，可以帶菌培養(yǎng)，也可以除菌后無菌培養(yǎng)。進(jìn)行帶菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，不添加土豆、香蕉提取液和椰乳有機(jī)物。無菌培養(yǎng)的除菌方法：先將帶菌根狀莖，用無菌水涮洗2～4遍，去除部分細(xì)菌，再根據(jù)根狀莖大小，用0.1％升汞藥液浸泡4～8分鐘，其間充分搖晃幾次，最后用無菌水涮洗4～6遍即可。