[發(fā)明專利]從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織中提取總RNA的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910094704.9
• 申請(qǐng)日: 2009-07-09
• 公開（公告）號(hào): CN101638651A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉迪秋;王繼磊;李文嫻;葛鋒;陳朝銀;田榮歡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C07H21/02
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 金耀生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織中提取和純化總RNA的方法。

背景技術(shù)

RNA的提取是分子生物學(xué)的基本內(nèi)容之一，高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行基因克隆、基因表達(dá)、基因功能分析等研究的必要前提。RT-PCR、Northern、real-time?PCR、cDNA文庫(kù)構(gòu)建等分子生物學(xué)研究的開展首先必須獲得純度高、完整性好的總RNA。植物組織特別是高等植物組織細(xì)胞內(nèi)外組成成分的復(fù)雜多樣性，使得植物組織RNA的提取比其他生物材料更加困難。對(duì)于梨屬、柑橘屬、中草藥的多種植物而言，分離純化組織中的RNA難度較大，因而嚴(yán)重阻礙了其分子生物學(xué)研究的進(jìn)展。富含酚類化合物和多糖類物質(zhì)，或含有大量已知和尚未確定的次生代謝產(chǎn)物，或內(nèi)源RNase含量較高是這些植物RNA提取的主要障礙。很多植物組織含有大量的多酚和多糖類物質(zhì)，酚類化合物在勻漿時(shí)極易被氧化成醌類物質(zhì)，與RNA不可逆地結(jié)合，從而影響RNA的分離純化。多糖的許多理化性質(zhì)與RNA相似，在提取過(guò)程中能與RNA共沉淀，很難將他們分開。在植物果實(shí)的發(fā)育過(guò)程中，包括RNase在內(nèi)的各種水解酶大量積累，同時(shí)富集多種次生代謝物質(zhì)。這些都會(huì)嚴(yán)重影響到RNA提取的質(zhì)量和數(shù)量。

目前，已經(jīng)發(fā)展了許多RNA的提取方法，如異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法(一步法)、十二烷基硫酸鈉(Sodium?Dodecyl?Sulfate，SDS)法、十六烷基三甲基溴化銨(Cetyltrimethylammonium?Bromide，CTAB)法和熱硼酸法等。這些方法中核心試劑分別為異硫氰酸胍、SDS、CTAB和硼酸。異硫氰酸胍能迅速破碎細(xì)胞，作為強(qiáng)變性劑使核酸-蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并有效解離核蛋白與核酸的復(fù)合體，最終釋放出核酸。SDS是一種離子去污劑，能從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖。CTAB作為離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使RNA游離出來(lái)。熱硼酸法的原理是將硼酸緩沖體系、蛋白酶K消化蛋白和LiCl選擇性沉淀RNA等步驟偶聯(lián)在一起。各種總RNA提取方法的步驟基本相似，首先徹底破碎植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，接著使核蛋白復(fù)合體中的蛋白質(zhì)充分變性，實(shí)現(xiàn)核蛋白與核酸的分離；同時(shí)抑制內(nèi)源和外源RNA酶的活性，防止RNA受污染而降解，然后將RNA與DNA、蛋白質(zhì)、多酚、多糖等物質(zhì)分離，最后檢測(cè)RNA的質(zhì)量。

Qiagen公司的RNeasy?Plant?Mini?Kit和Invitrogen公司的Trizol是提取植物RNA的最常用試劑盒，對(duì)于擬南芥、煙草、水稻等模式植物，使用總RNA提取試劑盒方便快捷。然而對(duì)于富含多糖多酚類物質(zhì)和次生代謝物質(zhì)的植物而言，RNeasy?Plant?Mini?Kit和Trizol等試劑盒不能有效地分離和純化其總RNA。近年來(lái)，有關(guān)從富含多糖多酚類物質(zhì)和次生代謝物質(zhì)植物中抽提RNA的方法已有較多的報(bào)道。Hu等(A?simple?protocol?for?RNA?isolationfrom?fruit?trees?containing?high?levels?of?polysaccharides?and?polyphenol?compounds.PlantMolecular?Biology?Reporter，2002，20：69a-69g)報(bào)道用改良的CTAB法從蘋果、桃和獼猴桃的果實(shí)中提取總RNA。張今今等(葡萄總RNA提取方法的研究。果樹學(xué)報(bào)，2003，20：178-181)用改進(jìn)的SDS/酚法從葡萄成熟葉片和完熟果實(shí)的果皮中成功提取了總RNA。徐昌杰等(柑橘組織RNA提取方法研究。果樹學(xué)報(bào)，2004，21：136-140)用改良Bugos法從甜橙葉片、幼果、完熟果皮和汁囊組織中獲得了較高質(zhì)量的RNA。周波等(富含多糖草莓果實(shí)總RNA提取方法的改進(jìn)。生物技術(shù)通訊，2004，15：48-50)提取草莓果實(shí)的RNA時(shí)，用丙酮去除類黃酮類色素，用乙二醇丁醚去除多糖。Xu等(Extraction?of?high?quality?of?RNA?andconstruction?of?a?suppression?subtractive?hybridization?library?from?chestnut?rose(Rosaroxburghii?tratt).Biotechnol?Lett，2006，28：587-591)在CTAB裂解液中添加PVP和巰基乙醇，并使用該法從多酚多糖含量特別高的刺梨葉片中獲得了高質(zhì)量RNA。