[發明專利]固體發酵生產纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的方法

有效

• 申請號: 200910093935.8
• 申請日: 2009-09-23
• 公開（公告）號: CN101671661A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發明（設計）人: 李榮杰;薛培儉;穆曉玲;尚海濤;李維理
• 申請（專利權）人: 安徽豐原發酵技術工程研究有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12R1/885;C12R1/685
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司
• 代理人: 張國良

技術領域

本發明涉及一種利用廉價固體原料通過固體發酵生產固體纖維 素酶、木聚糖酶、纖維二糖酶復合酶的方法。

背景技術

纖維質原料中纖維素、半纖維素、木質素分別占30-40％、15-30 ％、10-20％。纖維素作為植物光合作用的主要多糖類產物，是地球上 最為豐富的可再生性天然資源。據估計，地球上纖維素中所蘊藏的能 量大約相當于6400億噸的石油所含的能量，而且纖維素的可再生性 是石油等礦質能源所不可比擬的。充分利用纖維素酶處理纖維素，有 可能從根本上解決人類所面臨的能源與糧食問題，其深遠影響是不可 低估的。然而，目前約80％纖維素未被開發利用，具有極為誘人的 前景。

木聚糖在植物細胞壁中的含量僅次于纖維素，是半纖維素中含量 最豐富的一種。木聚糖是由D-木糖主鏈(以β-1，4鍵相連)和L-阿拉伯 糖分枝(a-1，2和a-1，3相連)所組成的聚合物。半纖維素木聚糖在木質 組織中占總量的50％，它結合在纖維素微纖維的表面，并且相互連接， 這些纖維構成了堅硬的細胞相互連接的網絡。這種堅硬的網絡阻礙了 纖維素酶對纖維素吸附，從而影響了纖維素的降解速率。

在天然纖維素水解成葡萄糖的過程中，必須依靠3種組分的協同 作用才能完成。纖維素大分子首先在C1酶和Cx酶的作用下逐步降 解成纖維二糖，而纖維二糖酶則進一步將纖維二糖水解成2個葡萄 糖。由于高濃度的纖維二糖對C1酶和Cx酶活力有強烈的抑制作用， 而在低濃度時則是纖維素酶的誘導物，如果纖維素酶復合組分中缺乏 纖維二糖酶組分就會嚴重影響纖維素的降解速率。

由于所使用的黑曲霉是高產木聚糖酶和纖維二糖酶的菌株，而綠 色木霉生產木聚糖酶和纖維二糖酶的能力較弱。故在發酵過程中，通 過木聚糖酶對木聚糖的水解可以降低其和纖維素的連接，從而增加了 纖維素酶對纖維素吸附。而纖維二糖酶則水解產生的纖維二糖，使纖 維二糖的含量在發酵過程中處于低濃度水平，從而誘導纖維素酶降解 纖維素。

發明內容

本發明的目的是針對纖維質原料發酵時利用率低、酶組成單一的 不足，提供一種操作簡便，成本低，酶活力高，酶組分配比合理的固 體發酵生產纖維素酶、木聚糖酶、纖維二糖酶的固體復合酶的方法。

一種固體發酵生產纖維素酶、木聚糖酶和纖維二糖酶的方法，采 用綠色木霉、黑曲霉為生產菌種，分別培養得到綠色木霉液體種子和 黑曲霉麩曲種子，然后將綠色木霉液體種子接入固體發酵培養基培養 3-8天后，再將黑曲霉麩曲種子的孢子洗下后接入正在培養的固體發 酵培養基中繼續培養8-12天，得同時含有纖維素酶、木聚糖酶和纖維 二糖酶的固體復合酶。

本發明所用綠色木霉(Trichoderma?viride)，優選保藏號為ACCC 30206的綠色木霉，可從中國農業微生物菌種保藏管理中心獲得；也 可以使用其它產纖維素酶的綠色木霉或里氏木霉；黑曲霉(Aspergillus niger)優選保藏號為CGMCC?3.3147的黑曲霉，也可以使用其它產 木聚糖酶和纖維二糖酶的黑曲霉。以綠色木霉菌株在玉米芯等農林廢 棄物上進行培養，一段時間后接入黑曲霉進行混菌培養。

本發明的方法，其中用于培養所述綠色木霉液體種子的種子培養 基按重量計為葡萄糖1-3％、玉米漿1-3％、尿素1-3％、硫酸銨0.5-2％、 磷酸二氫鉀0.2-2％，硫酸鎂0.2-1％，其余為水；用于培養所述黑曲 霉麩曲種子的麩曲瓶培養基按重量計為麩皮35-45％、玉米芯50-65％、 尿素1-3％、硝酸銨1-3％、磷酸二氫鉀0.5-2％。

本發明的方法，其中所述固體發酵培養基含麩皮、玉米芯、尿素、 硝酸銨或硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈷。優選配方為：重量 百分比的玉米芯60-70％；麩皮25-40％；硫酸銨1-8％；尿素1-5％； 磷酸二氫鉀1-5％；碳酸鈣1-5％；硫酸鎂0.1-0.5％；氯化鈷0.01-0.1％； 初始pH5.0-7.0。

本發明的方法，其中將綠色木霉先接入種子培養基中，在20-30 ℃下條件培養48小時，再接入固體發酵培養基；將黑曲霉先接入麩 曲瓶中，在20-30℃下條件培養4-8天，待綠色木霉接種培養3-8天 時再以營養鹽水洗下孢子接入正在培養的固體發酵培養基中繼續培 養8-12天。