[發明專利]一種篩選不同亞型單克隆抗體的方法

有效

• 申請號: 200910093730.X
• 申請日: 2009-10-15
• 公開（公告）號: CN102043051A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發明（設計）人: 趙懷璞
• 申請（專利權）人: 中國輻射防護研究院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 北京天悅專利代理事務所(普通合伙) 11311
• 代理人: 田明;任曉航

技術領域

本發明屬于單克隆抗體的制備技術，具體涉及一種篩選不同亞型單克隆抗體的方法。

背景技術

抗體主要分為IgM、IgG、IgA、IgD、IgE等五個類型，而通過生物技術制備雜交瘤細胞而獲得的單克隆抗體主要為IgG或IgM類型的單克隆抗體，單克隆抗體被廣泛應用于醫學、生物學等領域。單克隆抗體主要由B淋巴細胞合成，每個B淋巴細胞有合成一種抗體的遺傳基因。動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細胞系，含遺傳基因不同的B淋巴細胞合成不同的抗體。當機體受抗原刺激時，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個具有不同基因的B細胞，被激活的B細胞分裂增殖形成該細胞的子孫，即克隆由許多個被激活B細胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多種抗體。如果能選出一個制造一種專一抗體的細胞進行培養，就可得到由單細胞經分裂增殖而形成細胞群，即單克隆。單克隆細胞將合成一種決定簇的抗體，稱為單克隆抗體(簡稱單抗)。

單抗的制備過程較為復雜，試驗周期較長，由于動物個體差異、免疫方案、試劑等原因影響，篩選出來的單抗類型往往是隨機的。由于具有這種不確定性，經過大量的研究工作所獲得的單抗往往與期望能夠獲得的單抗類型不同，導致重復性工作，造成實驗時間、經費、資源等的浪費。

目前通常的單抗制備及鑒定方法流程如圖1所示，首先，從注射了抗原的實驗動物體內提取B淋巴細胞，并與骨髓瘤細胞進行細胞融合，形成雜交瘤細胞；然后，對所形成的雜交瘤細胞進行克隆化培養，使其大量培養增殖；最后，對細胞克隆化培養后的雜交瘤細胞分泌的抗體類型進行鑒定。雜交瘤細胞的克隆化培養是制備單抗過程中耗時較多的重要步驟。然而，目前的單抗制備過程只有在進行細胞克隆化培養后才可以對抗體類型進行鑒定，因此必須對所有融合細胞進行克隆化培養，并篩選陽性克隆，這就存在著一定的盲目性。當篩選的單抗其類型與預期不一致時，就必須再次從融合細胞中進行篩選或重新免疫動物再次獲得融合細胞。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的缺陷，提供一種能夠減少雜交瘤克隆化的工作量，避免盲目性的篩選不同亞型單克隆抗體的方法。

本發明的技術方案如下：一種篩選不同亞型單克隆抗體的方法，包括如下步驟：

(1)取細胞融合后所形成的雜交瘤細胞的培養上清液，離心去除懸浮的細胞及細胞碎片，獲得培養上清液A；

(2)將適量上清液A加入帶有濾膜的孔板，離心收集透過液B；

(3)將孔板翻轉后，加入洗脫液再次離心，使濾膜截留的組分充分洗脫，并收集截留組分溶液C；

(4)將孔板的各孔所對應的A、B、C液分別加入使用免疫原包被的抗原板孵育，根據免疫動物選擇相應的酶標二抗，進行ELISA試驗；

(5)根據試驗結果以及期望獲得的抗體類型，確定對哪一孔細胞進行克隆化培養。

進一步，如上所述的篩選不同亞型單克隆抗體的方法，在步驟(2)中，所述的濾膜能夠截留的分子量在150kD～900kD之間。

更進一步，如上所述的篩選不同亞型單克隆抗體的方法，在步驟(2)中，所使用的孔板規格為96孔、48孔或24孔。

進一步，如上所述的篩選不同亞型單克隆抗體的方法，在步驟(3)中，所用的洗脫液為0.01mol/L?PBS溶液。

進一步，如上所述的篩選不同亞型單克隆抗體的方法，在步驟(4)中，ELISA試驗的結果若A、B液呈現陽性，則該孔細胞分泌抗體類型為IgG；若A、C液呈現陽性，則該孔細胞分泌抗體類型為IgM；若A、B、C液均呈現陽性，則該孔細胞同時含有分泌IgG和IgM類型抗體的雜交瘤細胞。

本發明的有益效果如下：本發明對原有單抗制備(篩選)流程進行了改進，并結合膜過濾的方法，適當截留分子量，將融合后的雜交瘤細胞的培養上清進行過濾，培養上清中IgM型單克隆抗體將被截留于濾膜上，不會通過濾膜，而培養上清中IgG類型的單抗將同濾液一起通過濾膜；然后對濾膜上保留的組分和濾液分別進行檢測，就可以判斷所獲得雜交瘤細胞分泌的單抗類型是否為期望獲得的抗體類型，從而進行有目的的克隆化培養。

附圖說明

圖1為常用的單抗制備及鑒定方法流程示意圖；

圖2為本發明的方法流程圖；

圖3為增加了篩選步驟后的單抗制備及鑒定方法流程示意圖。

具體實施方式

本發明調整了單抗制備過程中的主要步驟，采用膜過濾的方法確定融合細胞中是否包含分泌特定類型抗體的雜交瘤細胞，減少了雜交瘤克隆化的工作量，降低了篩選單抗的盲目性。

如圖2所示，篩選不同亞型單克隆抗體的方法，包括如下步驟：