[發明專利]產β-葡萄糖苷酶的重組菌的構建方法

有效

• 申請號: 200910092527.0
• 申請日: 2009-09-10
• 公開（公告）號: CN101654680A
• 公開（公告）日: 2010-02-24
• 發明（設計）人: 李榮杰;徐斌;薛培儉;段緒果
• 申請（專利權）人: 安徽豐原發酵技術工程研究有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/81;C12N1/19;C12N9/42;C12P19/14;C12P19/12;C12R1/84;C12R1/685;C12R1/66;C12R1/69;C12R1/885;C12R1/645;C12R1/72;C
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明涉及一種產β-葡萄糖苷酶的重組菌的構建方法，特別是涉及一種可過量表達β-葡萄糖苷酶的重組畢赤酵母及其應用。

背景技術

β-葡萄糖苷酶(EC?3.2.1.21)的英文名稱是β-glucosidase，屬于水解酶類，又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解結合于末端非還原性的β-D-糖苷鍵，同時釋放出配基與葡萄糖體。β-葡萄糖苷酶在纖維素酶水解過程中將各種寡糖及纖維二糖降解為葡萄糖，為最后一步關鍵酶，對纖維素糖化水解具有關鍵性作用。β-葡萄糖苷酶還具有轉糖苷作用，在一定的條件下可以通過轉糖苷作用將兩個葡萄糖分子合成一個槐糖分子。已發現槐糖是纖維素酶基因表達的強誘導物。一般認為絲狀真菌中纖維素酶合成的誘導機制是：存在于分生孢子和菌絲表面的少量組成性纖維素酶首先降解纖維素生成纖維二糖等寡糖，然后在質膜結合的葡萄糖苷酶的轉糖苷作用下，生成槐糖等誘導物，經細胞膜上的組成性透性酶系統進人細胞內，啟動纖維素酶的合成。利用β-葡萄糖苷酶催化合成槐糖來誘導纖維素酶的生產具有巨大的商業價值和現實意義。

β-葡萄糖苷酶廣泛存在于植物、動物和微生物。在微生物中，曲霉被普遍認為是產生β-葡萄糖苷酶的優良菌種，其中尤以黑曲霉的產量最高。

β-葡萄糖苷酶應用廣泛。在纖維素利用上，通過基因重組技術構建工程菌，分泌表達高活性β-葡萄糖苷酶對纖維素有效降解具有重要意義。在飼料工業上，β-葡萄糖苷酶通過破解富含纖維的細胞壁，使其包含的蛋白質、淀粉等營養物質釋放出來并加以利用，同時又可將纖維降解為可被畜禽機體消化吸收的還原糖，從而提高飼料利用率。此外，在食品開發上，其作為特殊的風味酶已得到應用，在果汁、茶汁、果酒等制備上，能起到較好的增香效果。β-葡萄糖苷酶來水解大豆異黃酮糖苷，制備大豆異黃酮苷元。

β-葡萄糖苷酶的生產菌種主要有黑曲霉、無花果曲霉、青霉等。目前β-葡萄糖苷酶液態發酵酶活普遍偏低；而固態發酵生產β-葡萄糖苷酶成分復雜，不易提取。采用基因工程技術構建高產β-葡萄糖苷酶的工程菌株，具有重要的現實意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種產β-葡萄糖苷酶的重組菌的構建方法，特別是提供一種可過量表達β-葡萄糖苷酶的重組畢赤酵母及其應用。

一種產β-葡萄糖苷酶的重組菌的構建方法，從可提供β-葡萄糖苷酶基因的菌體中提取總RNA，利用RT-PCR技術獲得β-葡萄糖苷酶cDNA序列，連接到載體上得到重組質粒后轉化宿主，得到產β-葡萄糖苷酶的重組菌。

上述構建方法，其中所述可提供β-葡萄糖苷酶基因的菌體為黑曲霉(Aspergillus?niger)、海棗曲霉(Aspergillus?phoenicis)、棒曲霉(Aspergillus?clavatus)、米曲霉(Aspergillus?oryzae)、里氏木霉(Thichoderma?reesei)、嗜熱子囊菌(Thermoascus?aurantiacus)、孢原毛平革菌(Phanerochaete?chrysosporium)、菌膜假絲酵母(Candidapelliculosa)、扣囊復膜孢酵母(Saccharomycopsis?fibuligera)、青銅小單胞菌(Micromonospora?chalcae)、或農桿菌(Agrobacterium)。

上述構建方法，其中所述可提供β-葡萄糖苷酶基因的菌體優選為黑曲霉(Aspergillus?niger)。黑曲霉編碼的β-葡萄糖苷酶酶活比其它菌種產酶水平高。

上述構建方法，其中所述載體優選為pPIC3.5K，該載體能夠將黑曲霉β-葡萄糖苷酶編碼基因多拷貝整合進入畢赤酵母基因組中，并且能夠對β-葡萄糖苷酶進行分泌表達，有利于產物的高表達和純化分離。

上述構建方法，其中所述宿主為畢赤酵母。畢赤酵母具有許多優點，能夠高表達通過pPIC3.5K載體整合進基因組的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因，并對表達的β-葡萄糖苷酶蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等。