[發(fā)明專利]甲烷氧化混合菌的保存方法無(wú)效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 200910092357.6 | 申請(qǐng)日： | 2009-09-07 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN101638631A | 公開(kāi)（公告）日： | 2010-02-03 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 邢新會(huì);江皓;楊程;韓冰;吳昊;張翀 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 清華大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12N1/20 | 分類號(hào)： | C12N1/20;C12N1/04;C12R1/26;C12R1/07;C12R1/01 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 甲烷 氧化 混合 保存 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種甲烷氧化混合菌的保存方法。
背景技術(shù)
甲烷氧化菌是自然界中一類特殊的微生物，以甲烷為唯一碳源及能源，廣泛存在于泥土、沼澤、稻田、河流、湖泊、森林和海洋中。雖然某些甲烷氧化菌也可以同時(shí)利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能利用多碳化合物。甲烷氧化菌以其獨(dú)特的性質(zhì)和多樣的催化功能，在大宗化學(xué)品生產(chǎn)、新功能酶開(kāi)發(fā)、瓦斯氣體治理以及環(huán)境污染物的生物修復(fù)方面都具有極大的應(yīng)用潛力。甲烷氧化菌純培養(yǎng)生長(zhǎng)極為緩慢，功能不穩(wěn)定，且甲烷氧化菌純菌資源較少。
甲烷氧化混合菌是以甲烷氧化菌為主體的不同共生菌體的組合，相比純菌更有利于工業(yè)應(yīng)用。羅明芳等人研究表明，甲烷氧化混合菌具有高效降解苯酚、高效積累環(huán)氧丙烷的能力(羅明芳，等.含有甲烷氧化菌的混合菌群特性研究.微生物學(xué)報(bào)，2007，47(1)：103~109.)。在應(yīng)用混合菌時(shí)，其功能的穩(wěn)定，取決于穩(wěn)定的菌群結(jié)構(gòu)。平板傳代過(guò)程會(huì)丟失混合菌中的大量菌種，所以甲烷氧化混合菌的保存，不能使用純菌保存常用的平板傳代法。因此，迫切需要既簡(jiǎn)便易行，且能有效保持甲烷氧化混合菌的菌群結(jié)構(gòu)和功能的高效保存方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甲烷氧化混合菌的保存方法。
本發(fā)明提供的甲烷氧化混合菌的保存方法，包括將甲烷氧化混合菌菌體置于-70℃～-80℃凍存的步驟。可先離心收集菌體，然后將菌體進(jìn)行凍存。
所述甲烷氧化混合菌菌體的濕重為50mg以上。
應(yīng)用本發(fā)明的方法保存甲烷氧化混合菌時(shí)，建議每一年轉(zhuǎn)接活化一次。
所述甲烷氧化混合菌的制備方法可包括如下步驟：
1)采集煤礦或垃圾填埋場(chǎng)的土樣；
2)將步驟1)的土樣加入NMS培養(yǎng)基中，于密封瓶中培養(yǎng)；初始時(shí)，所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比為(5-30)∶(5-40)∶(30-80)；每24-72小時(shí)向密封瓶中置換入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比為(5-30)∶(5-40)∶(30-80)；
3)每8-12天接種步驟2)的培養(yǎng)液至新的NMS培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代；步驟2)的培養(yǎng)液與NMS培養(yǎng)基的體積比為(5-15)∶(95-85)；傳至10代以上，得到甲烷氧化混合菌。
所述步驟2)具體可為：初始時(shí)，所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比為5∶(2.5-3.5)∶(15-18)；每48小時(shí)向密封瓶中置換入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培養(yǎng)基、甲烷和空氣的體積比為5∶(2.5-3.5)∶(15-18)。
所述步驟3)具體可為：每10天接種步驟2)的培養(yǎng)液至新的NMS培養(yǎng)基，進(jìn)行傳代(培養(yǎng)方法同步驟2))；步驟2)的培養(yǎng)液與NMS培養(yǎng)基的體積比為10∶90；傳至第10代，得到甲烷氧化混合菌。
所述NMS培養(yǎng)基配制方法具體如下：將100ml溶液A和1ml溶液B混合并用水定容至1L，滅菌后加入10ml滅菌后的溶液C，得到NMS培養(yǎng)基；每升所述溶液A的配制方法為：將KNO3?10g，MgSO4·7H2O?10g，CaCl2·2H2O?2g，水定容至1L；每升所述溶液B的配制方法為：Fe-EDTA?0.38g，NaMoO4?0.26g，F(xiàn)eSO4?0.5g，MnCl2·4H2O?0.02g，CoCl2·6H2O?0.05g，H3BO3?0.015g，Na-EDTA?0.25g，ZnSO4·7H2O?0.4g，NiCl2·6H2O?0.01g，CuSO4·5H2O?0.025g，水定容至1L；每升所述溶液C的配制方法為：Na2HPO4·12H2O?71.6g，KH2PO4?26g，水定容至1L，pH值調(diào)至6.8。
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