[發(fā)明專利]一種抗持留狀態(tài)結核分枝桿菌的藥物篩選方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910092166.X
• 申請日: 2009-09-03
• 公開（公告）號: CN101643774A
• 公開（公告）日: 2010-02-10
• 發(fā)明（設計）人: 余利巖;邵天舒;岑山;黃彬;張玉琴
• 申請（專利權）人: 中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;C12Q1/32;G01N21/33;A61K45/00;A61P31/06
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發(fā)明涉及一種藥物的篩選方法，具體地，涉及抗持留狀態(tài)結核分枝桿菌藥物的篩選方法。

背景技術

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium?tuberculosis)引起的一種嚴重危害人類健康的慢性傳染性疾病。長期以來，人們對抗結核病的主要手段就是運用抗生素進行化學治療，這種治療手段一度有效地控制了結核病在世界范圍內的傳播和蔓延。然而近年來，原本已被有效控制的結核病大有卷土重來之勢，其發(fā)病率和死亡率均明顯回升，已成為與艾滋病、瘧疾并稱的傳染病。結核病死灰復燃的原因很多，包括人口流動性加大、HIV感染者增多以及多重耐藥菌不斷出現(xiàn)等。除此之外，結核病難以徹底治愈、容易復發(fā)，還與結核分枝桿菌能夠以“持留”狀態(tài)長期存在有密切關系。

感染人體的病原菌根據(jù)其與宿主細胞的關系可以分為胞外感染菌和胞內感染菌兩類，結核分枝桿菌就屬于后者。當其入侵機體后，巨噬細胞可以將其吞噬并形成“吞噬體”。一般說來，吞噬體形成后會與溶酶體迅速融合，由溶酶體產生的各種酶將其消化。而結核分枝桿菌在被巨噬細胞吞噬后，可以通過自身產生并分泌的一些物質，阻止吞噬體的成熟及其與溶酶體的融合，從而使其自身免遭轉運至溶酶體最終被降解的命運，而在巨噬細胞內長期存留下來。此時的結核分枝桿菌，代謝活動降至最低，生長繁殖幾乎停止，不易被抗菌藥物殺滅，這種類似于休眠的長期存活狀態(tài)被定義為“持留”狀態(tài)，這種狀態(tài)的結核分枝桿菌被稱之為持留菌，這是結核分枝桿菌逃避宿主免疫系統(tǒng)的進攻和抵抗藥物作用的一種手段。當機體免疫力下降，如被HIV感染、服用抗炎藥物或免疫抑制劑后，持留狀態(tài)的細菌又可恢復其生長繁殖活性，恢復致病力。結核桿菌之所以可以形成持留狀態(tài)長期存活，其原因是復雜的，涉及多方面的機制。近年來的研究表明，這種狀態(tài)的形成和維持，與其產生的蛋白激酶G(PknG)——一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶有密切關系。

結核分枝桿菌基因組共編碼11種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分別命名為PknA～B、PknD～L。它們與真核生物的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶一樣可以催化底物蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化。其中，PknG可以介導結核菌持留狀態(tài)的形成和維持。巨噬細胞在吞噬外來的病原微生物后形成初級吞噬體，初級吞噬體經過與胞內其他囊泡的一系列融合過程，特別是與溶酶體融合后，最終形成吞噬溶酶體，通過其中的水解酶類將吞入的病原菌消化，這一系列過程稱為吞噬體的成熟。吞噬體的成熟過程涉及巨噬細胞內的多條信號傳導通路，每條通路都受到胞質內的一些酶或者蛋白因子調控。PknG通過使胞質內某些與吞噬體成熟有關的關鍵蛋白質磷酸化來阻斷吞噬體的成熟過程，從而使被吞入的結核菌免遭降解的命運，在巨噬細胞內長期存活下來，而pknG基因突變的菌株則不能以持留狀態(tài)在宿主細胞內存活。

鑒于PknG對于結核分枝桿菌持留狀態(tài)的形成和維持有如此重要的作用，若能找到針對PknG特異而有效的抑制劑，則可以抑制結核分枝桿菌的持留，從而為解決結核長期潛伏性感染這一難題打下基礎。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種篩選抗持留狀態(tài)結核分枝桿菌藥物的方法，具體地講是一種以PknG為靶點，通過體外篩選PknG抑制劑來篩選抗持留狀態(tài)的結核分枝桿菌藥物的方法。

本發(fā)明通過將待測樣品與PknG接觸，篩選能夠抑制PknG活性的待測樣品，即為抗持留狀態(tài)結核分枝桿菌的藥物。

具體地說，將待測樣品適當稀釋后加入到如下反應體系中作為樣品實驗組：

反應物????????????????終濃度

Hepes?????????????????50～150mM

ATP???????????????????25～75mM

PEP???????????????????0.5～1.5mM

NADH??????????????????0.5～1.5mM

PknG??????????????????1～3μg/100μl

丙酮酸激酶????????????0.5～1.5U/100μl

乳酸脫氫酶????????????0.5～1.5U/100μl

同時以不添加待測樣品組作為陰性對照，與陰性對照組相比單位時間內OD₃₄₀值的變化越小，則對PknG的抑制率越高。待測樣品的終濃度可以是25～75mg/ml，可以根據(jù)具體的檢測對象稀釋到不同的濃度，例如可以設置多個濃度梯度來考察待測樣品對PknG的抑制。

優(yōu)選的所述反應體系如下：