[發明專利]一種產L-蘋果酸的基因工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 200910092043.6
• 申請日: 2009-09-07
• 公開（公告）號: CN101649300A
• 公開（公告）日: 2010-02-17
• 發明（設計）人: 李榮杰;徐斌;薛培儉;段緒果
• 申請（專利權）人: 安徽豐原發酵技術工程研究有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/21;C12N15/01;C12N15/76;C12N15/70;C12N15/74;C12P7/46;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種產L-蘋果酸的基因工程菌，以及該基因工程菌的構建方法和用途，特別涉及利用基因工程技術對生產L-蘋果酸涉及的關鍵酶進行改造，提高L-蘋果酸發酵水平。

背景技術

L-蘋果酸主要應用于食品工業，它是一種優良的酸味劑和保鮮劑。在各種果酒，乳酸菌發酵飲料，人造奶油中添加L-蘋果酸可最大限度保持天然果汁的風味。L-蘋果酸酸味刺激較為緩慢，且保留時間長，酸味比檸檬酸強20％，其與合成甜味劑一起使用還可消除后苦味，因而越來越為消費者所喜愛，L-蘋果酸和檸檬酸按合適比例添加到果汁中，可以使果汁更加接近于天然風味。

L-蘋果酸是三羧酸循環(TCA)的重要中間代謝物，可直接參與人體的代謝，可用于輔助治療貧血，肝功能不全和肝衰竭等疾病，因此在醫藥工業上也有重要的應用價值。

L-蘋果酸在細胞能量產生過程中發揮著重要的作用，L蘋果酸能誘導皮膚細胞的分裂，改善皮膚組織的生長，因而還可以用于化妝品工業。

由于L-蘋果酸的諸多優良特性，使其成為具有巨大應用前景的功能性食品添加劑，醫藥原料藥。

現有的L-蘋果酸生產技術主要有固定化細胞生物轉化法，生物酶法，化學合成法，微生物發酵法等，其中微生物發酵法最具應用前景。固定化細胞(酶)法生產工藝轉化率比較低，生產流程長，轉化液中產物含量不高，后提取成本較高。且生物酶轉化法使用的前體物質富馬酸鹽的用量大，原料來源窄。化學合成的蘋果酸存在D-型和L-型兩種旋光異構體，需要拆分，成本高，工藝復雜，技術難度大，設備昂貴，收率低，并且還存在廢棄物污染問題。

發明內容

本發明的目的在于針對上述不足提供一種基因工程菌，其無富馬酸酶(FumC)活性，從而使其L-蘋果酸的產量得到提高。

本發明的另一個目的在于提供上述基因工程菌的構建方法，通過基因工程改造，使其代謝流在蘋果酸向富馬酸轉化處中斷，從而積累目的產物L-蘋果酸。

本發明的再一個目的是通過微生物大規模發酵L-蘋果酸，以降低L-蘋果酸的生產成本。

為實現本發明的第一個目的，本發明提供一種產L-蘋果酸的基因工程菌，其出發菌為產琥珀酸的菌，所述菌株的富馬酸酶基因(fumC)突變，不具備富馬酸酶活性。這種突變可以是移碼突變、缺失突變、堿基替換或者插入突變等等，不論何種方法，其最終導致的結果是使該菌喪失富馬酸酶活性。優選使fumC基因缺失。

為進一步提高L-蘋果酸的產率，本發明利用蘋果酸脫氫酶(MDH)表達盒替換富馬酸酶基因。所述表達盒優選由該菌內源性啟動子與蘋果酸脫氫酶基因構成，更優選所述內源性啟動子為磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(pepck)的啟動子。

本發明產琥珀酸的菌可以是放線菌，也可以是產琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum?succiniciproducens)以及大腸桿菌(Escherichiacoli)，或上述的基因工程改造菌。

此外，還可以通過亞硝基胍(NTG)對出發菌進行誘變，經含單氟乙酸鈉(SMF)的平板培養基(MB)篩選，獲得SMF抗性菌株，這種抗性菌株的PEPCK酶活性得到了顯著提高，以這種菌作為出發菌可以進一步提高L-蘋果酸的產率。

為實現本發明的第二個目的，本發明提供一種構建上述菌株的方法，包括構建fumC打靶載體，導入出發菌，使fumC產生滅活性突變。如前所述，這種滅活性突變可以是移碼突變、缺失突變、堿基替換或者插入突變等致使的FumC的活性喪失。

此外，還可以利用打靶載體將富馬酸酶基因fumC替換為蘋果酸脫氫酶表達盒。這種表達盒優選采用該菌的內源性啟動子，例如使用pepck基因的啟動子。

使用本發明構建的基因工程菌進行L-蘋果酸發酵表明，與出發菌相比其L-蘋果酸的產量顯著提高，這表明本發明菌株可廣泛應用于L-蘋果酸的生產。